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关于CFSE测增殖的问题

发布者: cecily | 发布时间: 2019-7-10 17:44| 查看数: 124| 评论数: 5|帖子模式

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想请问各位小伙伴,我用CFSE测细胞增殖情况,目前我8ml人的全血大概可以分出1×10^7个/ml PBMC。我现在设置的阳性对照ConA的浓度梯度测增殖情况。分了两组,一组只加ConA,一组加ConA+20U/ml的IL-2。具体步骤如下:
1.  细胞用1ml 0.1%BSA重悬,
2.  加入1 ul CFSE(5mM工作浓度),37℃  10 min
3.  加入5倍体20% FB终止反应,4℃放置5min;
4.  400g 5min离心(感觉上清液还是有挺多细胞,离心速度能在能快点或者时间再长点吗?)
5.  PBS洗2-3次,离心弃上清400g 5min(感觉上清液仍有细胞未完全沉淀)
6.  10% FBS 1640重悬细胞,细胞密度调整为2×106个/ml
7.  细胞铺板到96孔板,每孔加200ul细胞悬液,然后加入刺激
8.  第5天收集细胞到流式管,400g 5min离心(但除了刺激最高浓度的一组,其他感觉管底未见明显沉淀,离心速度还能再快么?还是应该用2ml EP管收集以后最后重悬再转移到流式管呢?)
9.  用PBS洗2次
10.PBS重悬上机
附件是我的细胞照片和流式图片,好像还不是典型的CFSE的那种增殖图片,老师说就是有点那个感觉了,但是还不够典型,如果按我现在的结果,想问哪个浓度的ConA比较好呢?
新手入坑,问题比较多,谢谢大家!

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最新评论

niwanmao 发表于 2019-7-11 09:15:27
从CFSE增殖看,应该是5mg/ml conA+20U/ml IL-2这管增殖代数最多。
shinian 发表于 2019-7-11 10:25:13
本帖最后由 shinian 于 2019-7-11 10:28 编辑

flowjo软件有细胞增殖的分析功能
cecily 发表于 2019-7-11 15:54:27
niwanmao 发表于 2019-7-11 09:15
从CFSE增殖看,应该是5mg/ml conA+20U/ml IL-2这管增殖代数最多。

谢谢老师,但是我们学校帮我上机的老师就说我这个曲线好像不太好,他们觉得看增殖的代数分的不太清楚。
niwanmao 发表于 2019-7-13 16:42:21
cecily 发表于 2019-7-11 15:54
谢谢老师,但是我们学校帮我上机的老师就说我这个曲线好像不太好,他们觉得看增殖的代数分的不太清楚。 ...

这个增殖峰已经相当不错了,用Modfit软件或者FlowJo软件分析即可。
Cleopatra 发表于 6 天前
印象中人淋巴细胞是PHA刺激吧,动物是ConA,文献中很少看到用ConA刺激增殖呢,但是你的增殖图确实比我做的好看多啦
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