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OMIP-060:30参数流式评估T细胞和Treg功能

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-8-19 16:59| 查看数: 334| 评论数: 1|帖子模式

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更好地了解传染病和癌症的病理机制,对于改善目前的治疗方法和寻找新的治疗目标是很有必要的,特别是疫苗的研究。
高维度的流式细胞术能够在单细胞水平同时评估多种表面和细胞内蛋白的表达,并在稳态和疾病背景下描绘人体免疫系统。 这项强大的技术大大促进了对疾病机制的理解。
T细胞对于引发针对病原体或癌症的保护性免疫是至关重要的,并且通常涉及诸如自身免疫的疾病的病理机制。 因此,许多多色流式方案设计出来的目的是更好地理解T细胞应答。在2019年7月23日的Cytometry A杂志上,Thomas Liechti等人给我们介绍了一个30参数流式方案《[OMIP-060-30-Parameter Flow Cytometry Panel to Assess T Cell Effector Functions and Regulatory T Cells.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31334913)》,主要分析αβ和γδT细胞亚群的效应功能以及Tregs的特征。


方案和设计目的
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Tregs是一种独特的CD4+ T细胞亚群,能够抑制免疫反应,从而限制免疫相关疾病,如自身免疫和其他免疫病变。 这种独特的T细胞亚群的特征在于转录因子Forkhead Box P3(FoxP3)的高表达,其在免疫调节中起重要作用。证明FoxP3重要功能的例子是在缺乏功能性FoxP3的患者中能观察到明显免疫失调。
Tregs可以通过几种途径下调免疫反应。
Tregs上大量表达的高亲和力IL-2受体(CD25、CD122和常见γ链的复合物),能与其他T细胞竞争IL-2,导致IL-2剥夺。
此外,大多数Tregs表达CD39和CD73,这些酶对于将促炎性腺苷三磷酸降解为抗炎腺苷至关重要。
T细胞效应功能和Tregs特征的联合分析将提高我们对免疫稳态和免疫调节机制与T细胞效应功能之间相互作用的理解。
基于CD25和CD3+CD4+ T细胞内的经典转录因子FoxP3的表达定义了Treg(图1A,B),方案里面的CD39可以区分出CD39+和CD39-Tregs。值得注意的是,多发性硬化症与CD39+ Tregs比例降低有关,这突出了深入表征Tregs以更好地了解自身免疫性疾病的潜力。
T细胞在发育过程中从胸腺中的未成熟前体亚群到初始、记忆或效应阶段,表型不断发生变化,在此方案中,根据CCR7、CD27、CD28、CD45RO和CD95的表达,区分幼稚和记忆T细胞亚群。
活化的T细胞增殖并上调Ki67,Ki67通常用作近期增殖的标志物,虽然其功能仍然难以明确,但最近的研究提示其在细胞分裂期间参与染色质结构形成。Ki67既能够鉴定最近体内活化的T细胞,也能研究离体活化T细胞的回忆应答。
为了在体外刺激后检测活化的T细胞,方案中加入了广泛使用的活化标记物CD69,它可以提高检测细胞因子表达细胞的特异性,特别是使用刺激试剂,如多肽(只刺激一小部分T 细胞)(图1E)。
CD137是TNF家族的成员,提供共刺激信号,增强CD4 + T细胞应答和CD8 + T细胞细胞毒性。 由于其免疫刺激作用,CD137是癌症免疫疗法的潜在靶标。 然而,现在出现相互矛盾的结果是,CD137也可引起免疫抑制,其机制是通过在活化的Tregs上高表达。在本方案中也包括了CD137,并证实CD4+T细胞中CD137的最高水平发生在用PMA和离子霉素刺激后的Tregs内(图1E)。
方案中还包括共刺激分子CD154(CD40L),其在活化的CD4 + T细胞中上调。 CD154和CD40之间的相互作用对于B细胞的活化和高亲和力抗体应答的发展是至关重要的(图1F)。
肿瘤坏死因子(TNF)和IL-2在活化时由CD4+和CD8 +记忆T细胞普遍表达,并且通常用作T细胞效应子反应的标志物。 TNF是一种促炎细胞因子,具有激活和吸引中性粒细胞和单核细胞的能力。 除促炎活性外,TNF还参与免疫稳态和组织重塑。 IL-2主要由淋巴组织中的CD4 +和CD8 + T细胞产生,并且在T细胞稳态以及T辅助细胞亚群分化和CD8 + T细胞应答中起关键作用(图1F)。
CD4+ T细胞可分化为不同的辅助T细胞亚群,包括TH1、TH2、TH9、TH17、TH22和滤泡辅助T细胞(TFH),其特征在于独特的效应功能,如表达的细胞因子谱。本方案的目的是评估尽可能多的细胞因子,涵盖所有不同的辅助T细胞亚群。为此,在方案中包括干扰素γ(IFNγ; TH1)、IL-13(TH2)、IL-17(TH17)、IL-22(TH22)和IL-21(TFH),并分析不同辅助T细胞谱系的效应功能及其对免疫应答的贡献(图1F)。
IL-8,也称为CXCL8,是一种促炎性化学物质,可激活并吸引表达CXCR1或CXCR2的细胞,如中性粒细胞和单核细胞。人类新生儿不能发生经典的T辅助细胞反应,但具有高比例的独特的产生IL-8的T细胞亚群。在成人里面,尽管比例低得多,但还是可以检测到的。分泌IL-8的能力使这些T细胞能够通过吸引中性粒细胞和单核细胞来启动促炎环境。产生IL-8的T细胞的功能和起源仍然是难以捉摸的,有待进一步研究。由于IL-8的炎症效力和产生IL-8的T细胞的难以捉摸的性质,方案中包括了IL-8(图1F),并与其他表面标志物和效应分子组合,有助于更深入地了解产生IL-8的T细胞的功能。
细胞毒性CD8+ T细胞是重要的效应细胞,具有消除感染细胞的能力,基于对主要组织相容性复合物(MHC)I类背景下递呈的致病肽的识别。这些细胞表达高水平的颗粒酶B和穿孔素,这些颗粒对CD8 + T细胞的细胞毒性潜力很重要。此外,CD107a(LAMP-1)位于裂解小泡中,并且在激活依赖性脱粒后瞬时位于细胞表面,这使得我们能够检测脱粒的T细胞。方案中包括了所有三种分子以准确检测具有细胞毒性潜力的细胞和最近脱颗粒细胞(图1G)。
存储在裂解颗粒中的穿孔素和颗粒酶B在脱粒过程中分泌,之后就能通过流式细胞术检测。然而,用于细胞内细胞因子染色的蛋白质转运抑制剂莫能菌素和布雷菲德菌素A阻断这些细胞毒性蛋白从内质网(ER)转运到裂解颗粒,并阻止新形成的穿孔素和颗粒酶B的分泌 。此外,穿孔素在成熟过程中经历构象变化并转运至分泌颗粒。方案中选择针对重组形式的蛋白质而不是普通克隆δG9产生的穿孔素特异性克隆(B-D48),其仅检测主要在分泌囊泡中发现的构象。因此,蛋白质转运蛋白的组合和用克隆B-D48检测新合成的穿孔素的能力的组合使得能够分析活化诱导的穿孔素和颗粒酶B的表达(图1G)。
γδT细胞的特征在于识别独特的抗原,例如非经典MHC分子上呈现的磷脂和微生物代谢物,并能够发挥一系列不同的效应功能,如细胞因子的分泌(IFNγ、TNF和IL-17)和细胞毒性。基于这些特征,γδT细胞被认为能桥接先天和适应性免疫系统,因为它们的反应先于适应性免疫,这使得γδT细胞成为免疫系统的独特组成部分。为此,方案中除了γδT细胞受体以外,可进一步通过功能性分子对γδT细胞进行功能鉴定(图1H)。



设门和分析
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总之,这个30参数的方案,可用于未来的疫苗研究和研究,以利于更深入地了解T细胞效应功能在针对病原体或免疫病理的免疫应答中的作用。

最新评论

蒙牛一头牛 发表于 2019-8-20 15:39:20

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