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直标抗体和间标抗体的滴定步骤

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-8-22 11:47| 查看数: 321| 评论数: 5|帖子模式

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直标抗体滴定
  • 15000 X g, 4°C离心10分钟,去除底部团块,这些团块可能会是由于抗体互相之间粘附形成的沉淀。
  • 根据抗体包装说明写的抗体浓度(大多数抗体会在管壁标签上注明浓度,如果未注明浓度的,说明书上会有,如果说明书上也没有,可到官方网站查询或咨询厂商的客服),用PBS稀释,做6管稀释,例如:
    管1:10 µl抗体+ 20 µl PBS
    管2:从管1取10µl+ 20 µl PBS(相当于再稀释至1/3)
    以此类推,这样,你本次滴定只需用10µl抗体。
    这个是按照3倍稀释,你也可以把管1配得更稀一些,然后做倍比稀释。
  • 将要标记的细胞,事先用200 µg/ml相同种属的IgG重悬,密度为5~10×10E6/ml(这里起到Fc受体阻断作用)。
  • 取7管细胞,每管100 µl,置冰上。
  • 前6管,往每管细胞中10 µl对应已稀释好的抗体;第7管,只加细胞(看自发荧光水平);如果有加同型对照习惯的地方,可加上第8管,加同型对照,也可不做。
  • 混匀,置冰上,避光15 - 45分钟。
  • 加入2 ml冰冷的洗液(含2%BSA的PBS),轻轻混匀,200~500×g,4度离心5分钟。
  • 去上清,轻轻弹散细胞团块,重复第7步。
  • 去上清后,用100 µl不含蛋白质的冰冷PBS重悬,混匀。
  • 加入0.5ug/ml的PI染液,作为1~2分钟,上机检测,排除死细胞之后,滴定结果计算会更准确。


间标抗体滴定
  • 将要标记的细胞,事先用200 µg/ml相同种属的IgG重悬,密度为5~10×10E6/ml(这里起到Fc受体阻断作用)。
  • 根据抗体包装说明写的抗体浓度(大多数抗体会在管壁标签上注明浓度,如果未注明浓度的,说明书上会有,如果说明书上也没有,可到官方网站查询或咨询厂商的客服),用PBS稀释,做6管稀释,例如:
    管1:10 µl抗体+ 20 µl PBS
    管2:从管1取10µl+ 20 µl PBS(相当于再稀释至1/3)
    以此类推,这样,你本次滴定只需用10µl抗体。
    这个是按照3倍稀释,你也可以把管1配得更稀一些,然后做倍比稀释。
  • 取7管细胞,每管100 µl,置冰上。
  • 前6管,往每管细胞中10 µl对应已稀释好的抗体;第7管,只加细胞(看自发荧光水平);如果有加同型对照习惯的地方,可加上第8管,加同型对照,也可不做。
  • 混匀,置冰上,避光15 - 45分钟。
  • 加入2 ml冰冷的洗液(含2%BSA的PBS),轻轻混匀,200~500×g,4度离心5分钟。
  • 去上清,轻轻弹散细胞团块,重复第6步。
  • 去上清,将细胞用100µl已稀释好的荧光素结合二抗(例如羊抗小鼠FITC)重悬。
  • 混匀,置冰上,避光15 - 45分钟。
  • 按第6、7步洗涤两次。
  • 去上清后,用100 µl不含蛋白质的冰冷PBS重悬,混匀。
  • 加入0.5ug/ml的PI染液,作为1~2分钟,上机检测,排除死细胞之后,滴定结果计算会更准确。



滴定结果的计算
滴定结果的评估,有两种方法,一种直接肉眼观察阳性和阴性分离程度,还有一种是计算信噪比(阳性峰MFI-阴性峰MFI)除以(2×阴性峰SD)(注:信噪比公式网上可能有多种变异形式,但不影响最终判断,可选择这个最经典的公式)。
TITRE.jpg

至于那些阴性峰和阳性峰分不开的时候,怎么判断最佳用量?目前没有权威解释,我个人推荐是根据整体峰的MFI变化做一条曲线,找折线走势平缓的点,仅供参考。

滴定结果的应用及其注意点
在每次要使用某种抗体前,都需要进行滴定。滴定是依赖于温度、时间和其它条件的。例如:在用固定/破膜法和表面标记法两种情况下,滴定结果是不同的;而在滴定人类细胞和猴细胞,结果也是不同的。
按照前述步骤,你针对的最佳用量是针对50~100万个细胞的,那么如果你接下来准备用于标记1亿个细胞,千万不要将抗体用量也增加200倍,通常只要增加2-5倍即可,有时候甚至不增加用量也够用。如果你经常标记1亿个细胞(如分选细胞时),做2-3个点的快速滴定是很有用的。
同样的道理,如果你只标记5万个细胞,那么也千万不要减少抗体用量。记住,与抗体用量相关的指标是浓度(抗体量/染色体积)。
由于抗体浓度最关键,所以在100ul的体积下滴定出的抗体用量,如果染色时使用1ml的体积, 你就需要用10倍的抗体量。同样的道理,如果你在200ul体积下进行滴定,而染色时使用50ul体积,那么你就需要用1/4的抗体量。
所以一句话,滴定结果用于实际时,最需要关注的是体积。

编译并略做修改,信源:
1. Current Protocols in Cytometry, J Wiley & Sons, N.Y., eds. Robinson, J.P. et al, 4.1-4.4, 1997.
2. http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

最新评论

Veblen 发表于 2019-8-25 22:27:55
请问这里的SIGNAL 与NOISE分别从哪里来呢?是指MFI吗
niwanmao 发表于 2019-8-25 23:02:02
Veblen 发表于 2019-8-25 22:27
请问这里的SIGNAL 与NOISE分别从哪里来呢?是指MFI吗

分别指的是阳性峰的MFI和阴性峰的MFI
Veblen 发表于 2019-8-26 18:56:07
niwanmao 发表于 2019-8-25 23:02
分别指的是阳性峰的MFI和阴性峰的MFI

明白,谢谢倪老师。
justletitflow 发表于 前天 16:39
菜鸟提问,图中这几个浓度,哪一个浓度最好?1 μg? 0.1 μg看起来分离度不好吗?
niwanmao 发表于 前天 21:57
justletitflow 发表于 2019-9-19 16:39
菜鸟提问,图中这几个浓度,哪一个浓度最好?1 μg? 0.1 μg看起来分离度不好吗? ...

0.1最好,S/N最大。

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