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小鼠脾脏、淋巴结组织体外诱导分化Th1/Th2/iTreg/Th17详细步骤

发布者: niwanmao | 发布时间: 2019-8-28 16:44| 查看数: 397| 评论数: 4|帖子模式

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自20世纪后半期以来,CD4+T辅助(Th)细胞的不同谱系或亚群的概念渐渐普及。在共刺激信号存在下识别同源抗原导致数轮细胞增殖并最终分化成效应Th细胞,在该过程中产生的Th细胞的类型取决于活化期间存在的细胞因子环境。最初,天然Th细胞被认为在T细胞受体(TCR)激活、共刺激CD28连接和细胞因子信号传导后极化为2个不同的亚群:Th1和Th2。1型辅助细胞(Th1)的特征在于它们的效应子产生IFNγ细胞因子以及它们在分化过程中需要IL-12信号,核内有T-bet的表达,T-bet被认为是Th1分化的主要调节因子。此外,IL-12以及IFNγ可以促进T-bet表达。在免疫应答中,Th1细胞对于宿主防御细胞内病原体以及自身免疫炎症的强启动子是非常重要的。相反,2型辅助细胞(Th2)的生成需要IL-4,其效应细胞因子(包括IL-4,IL-5和IL-13)对于驱动B细胞反应很重要,并且在过敏中是致病的,与Th1细胞相似,Th2细胞也有自己的主转录调节因子,称为GATA-3。有趣的是,两个亚群之间的细胞因子能相互拮抗。

自发现Th1和Th2谱系以来,进一步研究证实了更多的T辅助细胞亚群,包括滤泡辅助细胞(TFH)、产生IL-9的Th9和产生IL-22的Th22、调节性T细胞(Treg)和产生IL-17的Th17等等。

CD25+调节性T细胞可以在胸腺中天然存在(nTreg),也可以由初始Th细胞诱导而成(iTreg)。两种类型的Tregs都表达一种特征性的转录因子,称为Foxp3,这对其效应抑制机制至关重要,包括可溶性抗炎介质产生、IL-2消耗和细胞接触依赖性机制。缺乏Foxp3表达导致严重的多器官自身免疫疾病,即免疫失调、多内分泌病、肠病X连锁综合征(IPEX),证明Treg在调节炎症和调节外周对自身抗原耐受中的关键作用。在体外,初始的CD4+T辅助细胞受到IL-2和TGF-β诱导刺激后,可上调Foxp3转化为Treg细胞。

昨天,站内有站友问Treg扩增的详细步骤(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7807-1-1.html),于是我们找到了一篇较为详细的Protocol《Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets》,编译分享。

1、分离小鼠淋巴结和脾脏

1、使用经机构批准的技术对所需数量的动物实施安乐死。 使用C57BL/6雌性小鼠,年龄5-10周,因为与雄性或老年小鼠相比,它们具有较高的初始T细胞百分比和较低的体脂。 注意:源自雄性小鼠的细胞在体外表现相似,并且方案步骤一致。 5-10周龄的雌性小鼠通常每只小鼠可获得3~6×10E6个初始CD4+T细胞。 然而,使用不同的小鼠品系可能会影响产量和性能。 例如,来自C57BL/6小鼠的细胞更好地产生Th1细胞,而来自Balb.c小鼠的细胞更好地产生Th2细胞。

2、如下图所示,展开动物的四肢并将它们固定到位。从肛门到下巴纵向切割皮肤,同时注意不要刺穿更深的组织。
20190828_153102.png

3、用镊子打开皮肤并将皮肤固定到位,以便于进入淋巴结,如上图所示。

4、从图所示的位置收集可触及的淋巴结。用一对镊子抓住淋巴结,同时用另一对镊子将组织分开,这样可以轻松取出。 将组织放入收集盘中。

5、从图中Spleen所示的位置收获脾脏。在这种情况下,需要仔细切入腹膜才能取到脾脏。 将组织放入收集盘中。

6、如果要收获更多组织,则重复该过程。 否则,请继续执行后续步骤。 此时,在冰上执行所有剩余步骤,直到分选后T细胞培养。

2、组织样本处理和CD4+T富集

1、切记在不同培养皿中处理淋巴结和脾脏,以增加细胞产量,因为淋巴结不需要红细胞裂解,否则容易导致部分白细胞死亡。 因此,以下步骤描述了分别处理脾和淋巴结群体的方法,然后在标记用于分选之前步骤合并。

2、从收集盘中取出组织(脾脏或淋巴结)并置于含有3ml PBS的新60mm培养皿中。 使用无菌镊子将一块无菌尼龙网放在组织上。

3、取注射器(3-10毫升),用活塞另一侧,轻轻地磨组织,将组织磨碎,见下图:
20190828_154051.png
(流式中文网提示:流式中文网的魔滤和魔杵,可以更方便而快速的研磨组织成单细胞悬液,详见https://detail.youzan.com/show/g ... &spm=f.46216002

4、上下吹打悬液几次,以打散剩余的一些细胞团块。在15毫升锥形管的开口处放置一块新的方形尼龙网,过滤悬液以除去残留的碎屑。

5、对于其它的淋巴结和脾组织重复步骤2-4。

6、一旦将悬液过滤到15ml管中,用PBS充满管的其余部分并倒置几次。 在4℃下以475×g离心细胞5分钟。

7、对于脾细胞,在离心后吸出上清液,并将细胞沉淀重悬于1ml冰冷的1X ACK溶液中1分钟以裂解红细胞。 然后在ACK上加入10ml PBS,倒置试管,并在4℃下以475×g离心5分钟。

8、对于淋巴结细胞,吸出上清液并重悬于2ml PBS中。

9、第7步离心脾细胞后吸出上清液,再悬浮于另外10ml PBS中。

10、现在开始CD4富集。 如果不需要富集,可直接跳过这几步,进入分选准备步骤。

11、要使用CD4磁珠分选,通常将在85μlPBS中稀释的15μl磁珠用于标记1只小鼠的组织。根据需要增加磁珠混合物的体积,重悬沉淀,并在4℃下孵育15-30分钟。

12、用10ml PBS洗涤细胞,使悬液通过尼龙网进入新的15ml管中以除去碎片,并在4℃以475×g离心5分钟。

13、将沉淀用100μlPBS重悬,并在高速磁性细胞分选系统上进行阳性选择。 如果使用手动分离系统,请按照制造商的说明进行浓缩。 或者,将样品重悬于FACS缓冲液:含有1mM EDTA(pH = 8)和1%BSA的PBS中,无菌过滤。

14、取出阳性富集部分,再用10ml PBS洗涤。 现在可以将富集的CD4级分标记用于分选。

3、分选初始CD4+T

1、用含有针对CD62L、CD44、CD25和CD4荧光抗体混合物标记细胞沉淀。每只来自一只小鼠的组织使用100μl体积的抗体混合物。

2、将沉淀重悬于抗体混合物中,并4℃、避光孵育15-30分钟。

3、用10ml PBS洗涤细胞,并在4℃下以475×g离心5分钟。

4、用尼龙网过滤团块或碎屑,将标记的细胞悬液转移到与细胞分选仪兼容的管中。将细胞保持在冰上并保护免受光照直到分选结束。

5、在分选仪兼容的收集管中,加入1-2ml完全RPMI培养基或FBS。

6、分选出CD4+CD25-CD62L+CD44-群体,即为初始CD4+T细胞。用完全RPMI培养基洗涤收集的细胞,如前所述离心。

7、将沉淀重悬于完整的RPMI中,计数初始T细胞,并将浓度调整至1×10E6/ml。

4、Th1/Th2/Treg/Th17体外诱导分化

1、事先用抗CD3和抗CD28包被孔板。对于48孔板,每孔加入0.5ml细胞悬液(即0.5×10E6细胞)。对于24孔板,每孔加入1ml细胞悬液(即1×10E6细胞)。

2、如果测试诸如药物之类的因素的影响,则根据实验,在分化过程之前,期间或之后将测试物质添加到相应的孔中。接下来,在培养基中加入相应量的细胞因子进行诱导。 Th0:30U/ml hIL-2。 Th1:15ng/ml rmIL-12、30U/ml hIL-2、5000ng/ml IL-4(克隆号11B11)。 Th2:10ng/ml rmIL-4、30U/ml hIL-2、2000ng/ml可溶性CD28(克隆号37.51)、5000ng/ml IFN-g(克隆号XMG1.2)。 iTreg:15ng /ml hTGFβ、30U/ml hIL-2、5000ng/ml IFN-g(克隆号XMG1.2)、5000ng/mlIL-4(克隆号11B11)。 Th17:20ng/ml rmIL-6、3ng/ml hTGFβ、5000ng/ml IFN-g(克隆号XMG1.2)、5000ng/mlIL-4(克隆号11B11)。

注意:上述优化条件供参考,各实验室如有条件,尽量进行优化。此外,除了板子上包被的CD28之外,再加入可溶性抗CD28可增强Th2细胞因子的产生,但对其他T细胞亚群没有影响。

3、将板子在37℃与5%CO2孵育4-5天。也可以在2天后去除TCR刺激物(即从原板中移出,避免CD3和CD28继续刺激),用新鲜培养基调节至1×10E6个细胞/ml,并在新孔(未包被)继续培养以增强增殖和最终产量。在这种情况下,不需要新的极化细胞因子和抗体,但应将10U/ml的IL-2加入到Th0、Th1、Th2和iTreg各孔的新培养基中。

5、流式检测诱导结果

对于通过流式细胞术的细胞因子分析确定Th0、Th1、Th2、Th17和iTreg比例。具体方法是,用10ng/ml PMA和1000ng/ml离子霉素或1μg/ml抗CD3再刺激每个孔4-6小时,同时加入高尔基体抑制剂(如brefeldin A),接着标记各亚群特异性的胞内细胞因子标记,以确定各亚群组成,如下图:
20190828_163441.png

看完之后,是否清楚了很多?

最新评论

苏沁沁 发表于 2019-9-6 09:13:22
感谢倪老师分享!
bingbingyan0714 发表于 2019-9-10 16:51:13
倪老师,第4项那里刺激用的细胞因子是哪个品牌的啊,或者说哪个牌子的好一些?在文献中没有找到,求助。。。@niwanmao
niwanmao 发表于 2019-9-10 22:57:50
bingbingyan0714 发表于 2019-9-10 16:51
倪老师,第4项那里刺激用的细胞因子是哪个品牌的啊,或者说哪个牌子的好一些?在文献中没有找到,求助。。 ...

基本上这些大厂家都有啊,美天旎、BD、Biolegend等公司均可。
bingbingyan0714 发表于 2019-9-11 11:42:28
好的,谢谢倪老师@niwanmao

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GMT+8, 2019-9-21 10:34

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