找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

查看: 9755|回复: 12

[细胞因子检测] 求流式检测脾脏组织的Th1/Th2/Th17/Treg的Protocol

[复制链接]
发表于 2012-12-3 13:47:00 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
我最近要做流式检测小鼠脾脏的Th1/Th2/Th17/Treg,但我从杀小鼠取脾脏到上机检测都没接触过,不知道取脾脏脾脏过程中需不需要无菌操作,一只小鼠的脾脏用淋巴细胞分离液分离的话能分离出多少细胞呢,老师让我单独完成,我鸭梨特大,想请教各位大侠给点意见,当然了,有这个Protocol那就更好了

流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2012-12-3 19:23:13 | 显示全部楼层
脾脏细胞的分离可参见  @laikete 站友的protocol中第二步 :http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1907-1-1.html
后续的染色,可参见你订购的试剂说明书,说明书上一般写的非常详细。
至于分析,可参见流式细胞术检测Th22/Th17/Th1/Th2/Treg的应用  
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2012-12-4 21:10:38 | 显示全部楼层
如果你分离的脾单个核细胞不用于培养的话,一般不用无菌操作。一个小鼠的脾大概能取10^8个单个核细胞。
关于脾细胞悬液制备,我们实验室是这样做的:
1.小鼠拉颈处死,75%酒精过一下
2 剪开腹膜,在胃后找到长条状脾,镊子小心分离,放入含2ml的4℃预冷PBS的平皿,将脾置于用两块毛玻璃片中间,平行研磨(可重复几次),再用2mlPBS将玻片残留细胞冲到平皿,静置1-2min
3 吸取研磨液过220目滤网,离心(4℃,14000,5min),弃上清,加1-3ml红细胞裂解液重悬(根据脾红细胞多少可调整),RT, 5-10min。离心,同前
4 洗涤:加2ml预冷PBS重悬,离心同前,弃上清。(此步骤可省)
5 加适量PBS重悬,计数(做流式不可少的一步)。我一般加2ml重悬,再取一点稀释100倍后计数。
至于Th1/Th2/Th17/Treg检测,倪老师给的建议和URL已经很好了!

评分

参与人数 1流星 +2 收起 理由
niwanmao + 2 很给力的步骤!

查看全部评分

流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2012-12-5 10:48:43 | 显示全部楼层
对,很给力的步骤,谢谢vtea!
再有,请教一下,我后面是要做流式检测,毕竟大部分都是胞内甚至核内的指标,分离之后还必须得刺激分泌细胞因子,那么如果说我在取脾脏分离单个核细胞时不采取无菌操作,细胞数量会不会大打折扣呢;
还有,流式检测Th1/Th2/Th17/Treg时我本来是想一个样同时检测这四群细胞的,但考虑到染色时的整个液体体积比较大,不知道抗体会不会被变相稀释,那如果是分两个管检测的话,哪些细胞群和在一起检测结果会比较好呢,恳请诸位老师的指教~
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2012-12-5 18:24:16 来自手机 | 显示全部楼层

放到一管里面检测可能对机器和荧光搭配要求比较高,不过不会影响你的染色体积啊,你可以适当调节标本量的。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-11-12 14:01:18 | 显示全部楼层
倪老师您好,我想请教一个问题:我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg,但是不想刺激测细胞因子。只用对应的转录因子测可不可以(包括以下抗体CD3,CD4,CD8,CD25,T-bet,GATA3,RORγt,Foxp3)?。还有就是这样测,做了两次发现除了Treg其他细胞比例太低,有时候很难说有还是没有,不知道是不是我的模板没建好。请问老师有什么好的建议吗?看到你的帖子“多色流式优化方案17:人CD4+辅助T细胞和滤泡辅助细胞”,全用的是膜表面的标记(CCR4- CCR6- CCR10- CXCR3+ Th1),不知道这样测业内认可度怎么样?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-11-13 09:56:02 | 显示全部楼层
kingkeer 发表于 2017-11-12 14:01
倪老师您好,我想请教一个问题:我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg,但是不想刺激测细胞因子。只用对 ...

有不少文献支持,具体你可以搜一下。
Th1/Th2/Th17的表面标记组合,目前有公司出了商品化组合。所以都是没有问题的。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2018-6-13 16:05:55 | 显示全部楼层
kingkeer 发表于 2017-11-12 14:01
倪老师您好,我想请教一个问题:我想测人外周血里面的Th1/Th2/Th17/Treg,但是不想刺激测细胞因子。只用对 ...

求教您最后是怎么做的
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2018-7-4 10:01:49 | 显示全部楼层
老师您好,请问如果提取的脾细胞不用于培养,要做Th1/Th2的测定,那么不做无菌操作,对加刺激剂和BFA后的孵育有影响吗?谢谢
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2018-7-4 10:49:51 | 显示全部楼层
Yuki飘 发表于 2018-7-4 10:01
老师您好,请问如果提取的脾细胞不用于培养,要做Th1/Th2的测定,那么不做无菌操作,对加刺激剂和BFA后的孵 ...

没有影响,我们都是在外面取的,然后在细胞室刺激5个小时,再拿出来在外面进行敷抗体等步骤
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2|浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2024-3-29 21:43

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表