请各位大侠们 CD3/CD28共刺激小鼠脾脏细胞（CFSE检测）

didi_zhou

pushiming77 发表于  4 天前

                               
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大家好，我做了很多次 CD3/CD28共刺激小鼠脾脏细胞（CFSE检测）这个实验，在显微镜下可以明显的看到细胞的增殖，但是在流式上检测，出现地增殖峰一点儿都不明显。我用的是96孔板，每孔20w脾脏细胞...

96孔板，200000细胞，是不是的条件就不对？你培养、刺激多长时间？200000脾脏细胞在96孔板里能都很好贴壁生长么？还是本来就会有接触抑制？这点可能应该考虑。是否应该用更大的孔板给细胞生长空间？先不考虑流式问题，建议你的培养条件可能要改改。

didi_zhou

一般96孔板长满细胞术就10000个左右，24孔板长满是2-5×10^5左右。脾脏细胞需要贴壁生长，这个浓度下去细胞的活性与增殖应该本来就会受影响。

pushiming77

didi_zhou 发表于 2013-6-25 21:10

                               
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一般96孔板长满细胞术就10000个左右，24孔板长满是2-5×10^5左右。脾脏细胞需要贴壁生长，这个浓度下去细胞 ...

脾脏细胞很小，只有很少量的细胞贴长（淋巴细胞不贴的，只是流沉于底生长）。众多文献用的细胞都是100000。还有文献更用到了200000。之外，我做的实验可以在显微下看到明显的增殖，增殖的细胞堆积，细胞浓度在200000的时候很明显，细胞少还不那么明显。

samly0

pushiming77 发表于 2013-6-25 20:49

                               
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很有用呀，谢谢老师

CFSE的浓度太高

samly0

didi_zhou 发表于 2013-6-25 21:06

                               
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96孔板，200000细胞，是不是的条件就不对？你培养、刺激多长时间？200000脾脏细胞在96孔板里能都很好贴壁 ...

小鼠脾脏淋巴细胞很小的，而且是悬浮细胞，铺96孔板是由于重力作用沉降到板底，不算贴壁生长的，你左右水平晃晃板子它会重新悬浮起来的，2x10^5浓度不算多，应该不会接触抑制

didi_zhou

samly0 发表于 2013-6-26 09:25

                               
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小鼠脾脏淋巴细胞很小的，而且是悬浮细胞，铺96孔板是由于重力作用沉降到板底，不算贴壁生长的，你左右水 ...

哦，原来是说的脾淋巴细胞……学习了学习了。

ddn111

感觉细胞浓度有点大，浓度调整后细胞活力会好点，另外LZ的96孔板如果用U、V型底比平底要好很多！

pushiming77

LZ的96孔板如果用U、V型底比平底要好很多，有这样的产品吗，是LZ是什么公司呀？

samly0

我也用过U型板，我在铺板前用抗体包被板子，刺激细胞效果更好点，具体做法是：在分离细胞铺板前，先计算包被用的液体总量（铺孔数x30ul培养基,记得另外扣除刺激抗体体积），建议多算1个孔的体积，再加入所需刺激抗体的总量（铺孔数x30ulx CD3/CD28单抗终浓度）, 混匀后到96孔板，每孔30ul，避免气泡，然后放常规CO2培养箱孵育1-2h，分离好的脾脏淋巴细胞调整终浓度为2x10^6/ml,取100ul/孔细胞悬液加入孔板，另加70ul/孔纯培养基补齐体积到200ul/孔。我有个师兄试过用PBS包被一个晚上的，效果也不错。

pushiming77

samly0 发表于 2013-6-27 16:24

                               
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我也用过U型板，我在铺板前用抗体包被板子，刺激细胞效果更好点，具体做法是：在分离细胞铺板前，先计算包 ...

就是先用抗体铺于板底吗？听起来有一点意思。必须试一下。
对了，师姐，你们实验部有LLC(C57BL/6的肺癌细胞)吗？