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自发荧光(auto-fluorescence)的概念?如何处理?

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发表于 2010-8-1 19:24:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

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细胞中某些分子,在紫外光或某个可见光波段时可发出荧光。这种荧光是由于细胞内源性的分子造成的,所以叫做自发性荧光(auto-fluorescence)。下图列出了几种常见的细胞内导致自发荧光的物质,这些自发荧光物质通常在短波长激发和发射,例如紫外和紫光区域激发的有色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等,蓝光区域激发主要是NADH、脂褐质、吲哚胺类、二聚体、核黄素。
屏幕快照 2015-11-11 下午5.39.34.png

大家在实验中最常见的细胞内自发荧光通常是由还原型嘧啶核苷酸 (NAD(P)H) 和氧化型核黄素 (FMN, FAD)引起,两者都是细胞代谢的标志物。线粒体NADH自发荧光通常作为细胞呼吸的一个标志物(Piston et al.,1995)。由于只有还原型的NADH才会有明显的荧光出现,所以当缺氧时,可导致NADH/NAD+的比例增加,表现为线粒体自发荧光的增高。

自发性荧光通常具有跟FITC和PE相似的激发和发射特性,所以可干扰这两类荧光标记的检测(如下面两个图,如果用直方图分析,就会造成GFP假阳性,直接干扰GFP的检测)。这就是为什么要在FL1 VS FL2点图上进行GFP表达的分析。
屏幕快照 2015-11-11 下午5.39.56.png 屏幕快照 2015-11-11 下午5.40.02.png

再看下面两幅图,第一幅用FL1/FL2散点图分析,很明显看出黄色区域是自发荧光,绿色区域是GFP正常荧光。如果换成第二幅这样的直方图来分析,就看到这些自发荧光明显影响了GFP表达率的正确分析。
屏幕快照 2015-11-11 下午5.40.22.png

屏幕快照 2015-11-11 下午5.40.17.png


那么如何解决自发荧光问题呢?方法如下:
1、通过设门排除,主要是FL1/FL2散点图,但有时候效果可能不是很好。
2、利用化学物质移除或淬灭。如台盼蓝。但可能会导致真实信号的降低。
3、利用FL1/FL2的MFI比值来判断。自发荧光通常是1:1,FITC/GFP通常是>1:1,PE通常是<1:1。
4、终极解决办法,就是尽量避免用FITC和PB通道的荧光素,改用PE、PerCP-cy5.5、PE-cy5.5、PE-cy7等,甚至采用红光激发的荧光素APC等。
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发表于 2015-11-11 13:17:36 | 显示全部楼层
为什么我看不到图片?是因为网速不行吗  倪老师
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 楼主| 发表于 2015-11-11 17:51:25 | 显示全部楼层
jessica77543 发表于 2015-11-11 13:17
为什么我看不到图片?是因为网速不行吗  倪老师

这是数年前的旧帖,因为当时搬迁服务器时数据丢失了。现在已经把图片补上了。请重新审查:)
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发表于 2016-11-6 11:03:15 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-11-11 17:51
这是数年前的旧帖,因为当时搬迁服务器时数据丢失了。现在已经把图片补上了。请重新审查:) ...

PB通道是什么,没见过这个通道,可否解释下??谢谢倪老师
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 楼主| 发表于 2016-11-7 08:36:33 | 显示全部楼层
cdm874386070 发表于 2016-11-6 11:03
PB通道是什么,没见过这个通道,可否解释下??谢谢倪老师

Pacific Blue,是Violet激光激发的,405nm激发,450nm检测。
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发表于 2016-11-9 10:19:46 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-11-7 08:36
Pacific Blue,是Violet激光激发的,405nm激发,450nm检测。

哈哈,谢谢老师的耐心指导
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发表于 2023-7-25 11:39:11 | 显示全部楼层
倪老师,关于自发荧光,本底荧光,仪器的背景信号/噪音,阴性细胞群的信号,等这几个概念,有比较明确的解释吗?我们平时做实验,只检测了一管细胞,没有染抗体的,那出来的阴性信号是属于本底荧光?这里面会掺杂仪器的电子噪音吗?仪器的电子噪音,这个怎么判断?
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 楼主| 发表于 2023-7-25 21:42:36 | 显示全部楼层
wmj123456 发表于 2023-7-25 11:39
倪老师,关于自发荧光,本底荧光,仪器的背景信号/噪音,阴性细胞群的信号,等这几个概念,有比较明确的解 ...

未染色细胞,跑出来的信号,包括了电子噪音、细胞内代谢产物的自发荧光(即本底)

电子噪音,是用纯水跑的时候,看到的信号(前提是先保证液路是干净的)。
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发表于 2023-7-26 14:46:09 | 显示全部楼层
倪老师,我现在也遇到了这个问题,我不太清楚为什么GFP荧光微珠的补偿效果还不如FITC类的荧光素
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 楼主| 发表于 2023-7-26 16:31:14 | 显示全部楼层
zdvfsadb 发表于 2023-7-26 14:46
倪老师,我现在也遇到了这个问题,我不太清楚为什么GFP荧光微珠的补偿效果还不如FITC类的荧光素 ...

能具体描述一下吗?
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