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[流式protocol] 获得完美DNA细胞周期的关键点

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发表于 2014-5-27 21:10:58 | 显示全部楼层 |阅读模式

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DNA细胞周期是流式细胞术非常重要的技术,它看似容易。但实际上为了获得正确的分析结果,需要记住若干关键点。
  • 获取足够的事件。细胞周期分析需要用某个数学模型拟合数据,这些模型对S期、G1、G2/M期进行了不同的假设性推算,因此,需要有足够多的数据供模型拟合。为了获得足够的数据,从G1峰开始到G2/M峰末尾之间的每个channel均需获取到100个事件,也就是说,假如G1峰的起始处位于40000道,G2/M峰末尾位于110000道,那么应获取的事件数量应该是(110000-40000)×100=700万个事件。



  • 记得化学计量学。DNA染料的浓度需要足量,以使其能够与细胞内的DNA含量成正确的比例结合。因此在染色前应该进行精确的细胞计数,并确保加入正确量的DNA染料。




  • 别忘记使用RNA。一些染料(例如PI)会同时结合DNA和RNA,如果使用PI,必须在染色缓冲液中加入RNAse。如果不这么做,会导致DNA直方图很差。


  • 注意CV。G0/G1峰的CV值是衡量DNA直方图质量的一个标准,它可以被流速、激光校准等因素影响(见下图)。流速越低,CV值越小,所以在正确校准的机器上低速获取DNA样本对于结果十分关键。

    流速对细胞周期CV的影响

    流速对细胞周期CV的影响



  • 注意排除粘连体。粘连体容易与G2/M期细胞混淆起来(见下图),所以需要通过以下三个方式减少其干扰:制备好的单细胞悬液;注意固定操作并记得在上样前过滤标本;确保分析时使用H、W和A等参数来设门排除粘连体。

    粘连体容易与G2/M期细胞混淆起来

    粘连体容易与G2/M期细胞混淆起来


  • 控制细胞周期。建议在所有的实验中均加入一个DNA细胞周期质控品,这样可以更好地确定细胞周期的改变,允许你比较不同样本/机器/日期之间的结果,以提高可重复性和可信度。最常用的质控品是鸡红细胞和鲑鱼红细胞。
总之,细胞周期是流式细胞术中非常重要的工具,但其中还是有不少需要优化的步骤,不要认为在样本中加入一些PI就能够得到好的DNA直方图。选择最好的固定剂、正确的染料、良好的仪器都对DNA细胞周期非常重要。
 楼主| 发表于 2014-11-19 21:08:06 | 显示全部楼层
huikaimin 发表于 2014-11-19 20:20
我最近做流式发现cv值和细胞也有关系。明天发个贴探讨下。

细胞状态好坏应该是会影响CV值。欢迎明天发帖探讨。
发表于 2014-6-6 15:18:40 | 显示全部楼层
老师,您那个CV的图是哪篇文献里的?看文献里给的峰图有的很好看,边缘很光滑,有的边缘就很粗犷,这是什么原因呢?跟CV的关系大么?您有讲CV的一些资料推荐么?
 楼主| 发表于 2014-6-6 19:43:22 | 显示全部楼层
椴树 发表于 2014-6-6 15:18
老师,您那个CV的图是哪篇文献里的?看文献里给的峰图有的很好看,边缘很光滑,有的边缘就很粗犷,这是什么 ...

一般从G1峰的基底宽度大致可以看出CV值的大小的。CV值除了跟机器本身、液路有关,还跟流速有关。
发表于 2014-9-23 09:14:43 | 显示全部楼层
椴树 发表于 2014-6-6 15:18
老师,您那个CV的图是哪篇文献里的?看文献里给的峰图有的很好看,边缘很光滑,有的边缘就很粗犷,这是什么 ...

边缘很粗犷和你收集的细胞多少页有关系,因为周期左右的结果图是直方图,当达不到一定的采集数量,图谱会比较毛糙。建议在能收集大量的情况下,建议多收一点。至少P2图圈3万以上。
发表于 2014-10-14 15:32:51 | 显示全部楼层
学习一下,谢谢分享
发表于 2014-11-19 20:20:59 | 显示全部楼层
我最近做流式发现cv值和细胞也有关系。明天发个贴探讨下。
发表于 2016-9-20 12:01:31 | 显示全部楼层
本帖最后由 轩辕河图 于 2016-9-20 12:03 编辑

@niwanmao 倪老师,关于控制细胞周期有没有具体的教程和实验步骤啊?
 楼主| 发表于 2016-9-20 14:20:26 | 显示全部楼层
轩辕河图 发表于 2016-9-20 12:01
@niwanmao 倪老师,关于控制细胞周期有没有具体的教程和实验步骤啊?

你的意思是细胞同步化吧?Nature上有详细的药物列表,可实现对周期的同步化调控:http://www.nature.com/nprot/jour ... ot.2013.011_T1.html
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