流式细胞术补偿调节9条准则

niwanmao

流式细胞术补偿调节9条准则：
1、用于调节补偿的标本必须单染。
2、样本必须可染出一群阳性和一群阴性，以比较它们之间的平均荧光强度。
3、可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿（例如在稀有细胞检测时）。
4、使用表达强度高的抗体来调节补偿。
5、用来调节补偿的抗体必须与实验用的抗体荧光素一样（例如不能用FITC调节GFP的补偿）。
6、串联染料的抗体如果批号不同，需要再次做补偿。
7、阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。
8、补偿微球可以代替细胞（不过允许做微调）。
9、千万不要做不设置补偿的实验。

（译自美天旎MACS-Academy-Compensation-of-spectral-overlap-in-flow-cytometry）

peansant

origin of these rules (english edition)

苏格兰白草莓

INTORNS 发表于 2014-6-5 22:28
倪老师：
        对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
       我们买的beckman coulter的仪 ...

我觉得应该这样理解，我们调节荧光补偿的目的是因为不同的染料被激发光激发后所发射的波长是不一样的，正因为发射波长的宽度不一样，才会产生通道之间会有不同的干扰信号出现，为了排除这些杂信号，也可以说说所谓的假阳性，我们就需要人为的调节荧光补偿，将杂信号排除，以得到更纯粹一些的信号。所以即便是电压一定的，但是因为荧光物质不同，补偿就会不同，这是荧光物质本身特性来决定的。这就是为什么在同一电压下，你做FITC和做GFP的补偿会是不一样的。换用抗体的话，只是结合效率不相同，但是不同抗体标记相同荧光物质（严格来说甚至是生产公司及批号也要一致）发射波长的宽度范围是不变的，所以换用抗体从理论上讲是可靠的，只是荧光强度不一样，会更亮或者更暗一些。
不过现在随着时代的进步，已经开发出了很多优质的荧光染料，不仅激发效率高，发射波长的范围也很窄，大大提高了流式检测的灵敏度及同时进行更多颜色标记的检测。
在今年的流式年会上重点就提到了这些新型染料，在论坛中应该有提及到的帖子，你可以关注一下。

vtea

3和4会不会鱼与熊掌不可兼得？经常碰到目的分子表达不高，甚至不确定是否会表达，这个时候就只能用其他抗体代替，这样的补偿对结果分析误差大吗？

INTORNS

倪老师：
        对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
       我们买的beckman coulter的仪器，他们技术人员讲每次补偿的时候都必须使用同批次的样本细胞，而且使用实际样本上的抗体及荧光素。所以即使同一荧光素，换用抗体的话，因为结合效率等因素的影响，补偿结果可靠吗？包括使用荧光微球替换细胞，这个目前我们真不敢用。因为我在想，如果第3条和第9条成立的话，通道电压一定的情况下，对于任何细胞样品，通道之间的补偿值不就是一个定值了吗？而这个我问过他们的技术人员，他们讲即使电压一定，补偿值也不是定值，每次都需要调节。
        另外，对造血干细胞（lineage-Sca+Kit+）的检测，其中的lineage是一个系列混合抗体，所以我们在做补偿的时候阴阳性分群不明显，只能大概不准确调节了。如果如您所说，可以替换抗体，倒是可以避开这一问题。
        谢谢！
        

INTORNS

苏格兰白草莓 发表于 2014-6-6 00:24
我觉得应该这样理解，我们调节荧光补偿的目的是因为不同的染料被激发光激发后所发射的波长是不一样的，正 ...

       我理解您的意思。
       但是电压等条件一定的条件下，相同的荧光素偶联相同的抗体，只是细胞样本不一样（这里的不一样指相同细胞不同批次以及不同种类细胞两种情况），那补偿需要重新调节吗？公司的技术人员说需要重新调节，按照您的意思就是不用了。
       就新型染料来说，目前我们还是倾向于使用经典的常用的染料，这样不仅方便参考文献，而且还适合仪器。
       谢谢！

苏格兰白草莓

INTORNS 发表于 2014-6-6 09:35
我理解您的意思。
       但是电压等条件一定的条件下，相同的荧光素偶联相同的抗体，只是细胞样 ...

严格意义上来说，每做一个批次都应该调补偿，但是考虑到成本问题，我们一般是
同样细胞不同批次的，会每周做一次补偿，如果是平时做质控发现激光衰减之类的，我们也会重做补偿，你要是每个批次相隔时间比较久也建议每次做补偿，毕竟我说的是在理论情况下，现实之中仪器的激光会有衰减，或者遇到一些其他的情况，所以还是建议同种细胞，隔一段时间做一下补偿
对于不同种类的细胞，我们还是都要求要做补偿的，因为每种细胞可能出现的自发光，或者是药物处理之后，有些药物会自发光留在胞内，这些情况都建议最好是要做补偿

INTORNS

苏格兰白草莓 发表于 2014-6-6 10:48
严格意义上来说，每做一个批次都应该调补偿，但是考虑到成本问题，我们一般是
同样细胞不同批次的，会每 ...

好的，我们会参考您所说的方法。谢谢您的回答。

niwanmao

vtea 发表于 2014-6-5 22:03
3和4会不会鱼与熊掌不可兼得？经常碰到目的分子表达不高，甚至不确定是否会表达，这个时候就只能用其他抗体 ...

3、4本来就是一致的啊，就是应该尽可能用强度高的来调节补偿。

niwanmao

INTORNS 发表于 2014-6-5 22:28
倪老师：
        对于第3条和第9条，有一些疑惑和问题想要请教一下。
       我们买的beckman coulter的仪 ...

同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对真实标本有较好的参考，当然，真实细胞可能还会有点些许差别。compbeads在某个荧光标记抗体找不到强表达的时候特别有用。

如果你做某一项实验的话，强烈建议保持稳定的电压和补偿，尽量不动，至少我们在做临床上免疫分型时都是遵循此项原则。

对于lin系列的混合抗体，是可以通过替换抗体来调节补偿，我认为问题不大。

INTORNS

niwanmao 发表于 2014-6-6 19:48
同一荧光素的抗体，结合效率不同影响的是荧光强度，而不是补偿。
compbeads可以帮助确定补偿的大致值，对 ...

好的，我明白了。谢谢倪老师的回答！