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[流式protocol] JC-1检测凋亡细胞

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发表于 2014-6-12 23:14:12 | 显示全部楼层 |阅读模式

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JC-1 (5, 5´, 6, 6´-tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide)是一种亲脂性荧光阳离子染料,可掺入线粒体膜,由于线粒体生理性膜电位的存在,形成聚集体。聚集后,JC-1的荧光性质就发生了改变,从绿光转换为橙光。完整的活细胞JC-1染色后,可显示线粒体显著的橙光,可被流式细胞仪FL2通道检测到,而凋亡细胞由于线粒体膜电位的降低,从而使得橙色荧光降低,而绿色荧光略增高。通过这种荧光变化,就可以使凋亡细胞和非凋亡细胞区分开来。
对于自配试剂的,JC-1一般用DMSO配成1000x储存液(5 mg/ml)
如果是标记贴壁细胞,需先将JC-1储存液用培养基稀释至5 µg/ml的工作液(稀释时注意边稀释边振荡,以防止沉淀形成),然后再将加了JC-1的培养基加到贴壁细胞中,37℃孵育10分钟或室温15分钟,最后用PBS洗涤两次、胰蛋白酶消化,500 µl PBS重悬,上机分析。
如果是悬浮细胞,可将悬浮细胞与用培养基稀释至10 µg/ml 的JC-1溶液以1:1混合,最终浓度5 µg/ml,同样37℃孵育10分钟或室温15分钟,最后用PBS洗涤两次,500 µl PBS重悬,上机分析。

FL1和FL2大致的补偿如下:
FL1-7% FL2
FL2-74% FL1

示例结果:
Mitochondrial-Transmembrane-Potential.jpg

 楼主| 发表于 2015-2-2 12:23:25 | 显示全部楼层
风车 发表于 2015-2-2 11:19
倪老师回复这么及时~太谢谢了。那比例要求呢?98%~99%?

参照本帖的附图即可,JC-1设门要求没象别的分析那么严格,关键还是看变化趋势。
发表于 2014-7-13 22:44:18 | 显示全部楼层
倪老师,我们正在做JC-1的实验,数据也很明显能够看到橙光细胞群因药物由强变弱由多变少,且绿光细胞群逐渐增多增强,但是分析的数据不尽人意,明明光看图都看得到变化,但是如果按照文献上那个绿光/橙光比值就不怎么有明显变化了,很奇怪的是有些文献比值相差好几倍,有些又只有几分之几,还有就是那个比值很多文献也没明确说明到底是什么的比值,是阳性百分比还是平均荧光强度,如果是荧光强度,那么到底是整个通道的荧光强度平均值相比,还是说只是阳性门内的荧光强度的均值,希望能够在数据处理上能够有人提点一下,谢谢了先!!!
 楼主| 发表于 2014-11-14 21:10:36 | 显示全部楼层
HGYFGCTDTDTF 发表于 2014-11-14 15:39
倪老师,请问流式检测线粒体膜电位(JC-1)的结果中,双染区域如何分析呢? ...

顶帖的图片已经更新,更清楚地告诉你如何分析双染细胞群了。
左侧是未补偿的,右侧是调节好补偿的。
发表于 2014-6-17 00:17:47 | 显示全部楼层
学习了。谢谢分享
 楼主| 发表于 2014-7-14 07:21:03 | 显示全部楼层

如果出现明显的分群,我建议你分析百分比。如果分群不明显,可以采用FL2的荧光比值。来自: Android客户端
发表于 2014-11-14 15:39:45 | 显示全部楼层
倪老师,请问流式检测线粒体膜电位(JC-1)的结果中,双染区域如何分析呢?
发表于 2014-12-24 18:53:15 | 显示全部楼层
好的,谢谢您倪老师!
发表于 2014-12-29 09:41:01 | 显示全部楼层
谢谢倪老师的分享!
发表于 2015-2-2 10:05:31 | 显示全部楼层
倪老师您好,我刚开始做jc-1,流式分析,请问十字象限线如何确定?及各象限的含义是什么?先谢谢了!
 楼主| 发表于 2015-2-2 10:48:28 | 显示全部楼层
风车 发表于 2015-2-2 10:05
倪老师您好,我刚开始做jc-1,流式分析,请问十字象限线如何确定?及各象限的含义是什么?先谢谢了! ...

结合阳性对照和阴性对照进行设门。
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