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[标本处理] 抗体孵育时间

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发表于 2014-8-1 23:14:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 fdgg012345 于 2014-8-2 13:23 编辑

倪老师@niwanmao ,我一个抗体(胞膜)用的是间标,一抗是之前买过来做免疫组化的,试着做了一下流式,但是阳性比例感觉比预期低很多。做免疫组化时,孵育时间是4摄氏度过夜或者37摄氏度1h,而我做流式时只是室温孵育了30min,是不是太短了?请问也应该和免疫组化一样的孵育吗?(因为我其他流式抗体,说明书上说冰上避光15-20min即可,相对免疫组化孵育时间很短,是因为流式很敏感只需结合一点抗体就行呢,还是说针对流式的抗体结合效率很高呢?)

 楼主| 发表于 2014-8-2 13:25:16 | 显示全部楼层
查了一下,好像做流式时抗体的浓度比免疫组化要高许多,难道流式是需要高浓度短时间吗?
发表于 2014-8-3 18:31:17 | 显示全部楼层
fdgg012345 发表于 2014-8-2 13:25
查了一下,好像做流式时抗体的浓度比免疫组化要高许多,难道流式是需要高浓度短时间吗? ...

我觉得可能跟染色条件有关,流式的标本都是活细胞悬浮在那里的,需要较高浓度渗透,而免疫组化的标本都预先经过福尔马林等固定过,细胞平铺在那里,容易染上。不管如何,不能因此而说流式敏感性差。
流式可以检测数万甚至数百万细胞,效率绝非免疫组化能比,并且特异性高。至于流式的染色条件,只要你的抗体质量过关、标本状态好,一般15-30分钟常温足够。
 楼主| 发表于 2014-8-3 20:01:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关,流式的标本都是活细胞悬浮在那里的,需要较高浓度渗透,而免疫组化的标本都预 ...

好的,谢谢老师,我换成浓度高一点的再试试。
 楼主| 发表于 2014-8-3 20:18:31 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关,流式的标本都是活细胞悬浮在那里的,需要较高浓度渗透,而免疫组化的标本都预 ...

倪老师,下面是我的图片,第一张是同型对照,给它设了一个门,网上看到说控制阳性细胞2%以下就行,请问这样可以吗,是否需要再往右上一点?
第二张是实验组的图,按之前的十字门,细胞在中间被分成了四份,但自身没有分群的迹象,感觉是被人为分开的,这种情况是不是有问题,我需要做单染组来设门吗?

X.同型对照

X.同型对照

E.实验组

E.实验组

发表于 2014-8-3 22:22:06 | 显示全部楼层
fdgg012345 发表于 2014-8-3 20:01
好的,谢谢老师,我换成浓度高一点的再试试。

有关抗体滴定请参考以下两个帖子:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2484-1-1.html

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html
发表于 2014-8-3 22:44:07 | 显示全部楼层
fdgg012345 发表于 2014-8-3 20:18
倪老师,下面是我的图片,第一张是同型对照,给它设了一个门,网上看到说控制阳性细胞2%以下就行,请问这 ...

做一个单染试试,另外,抗体的浓度也会影响到非特异性荧光的强度,过高、过低均不好。
发表于 2019-9-9 16:50:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2014-8-3 18:31
我觉得可能跟染色条件有关,流式的标本都是活细胞悬浮在那里的,需要较高浓度渗透,而免疫组化的标本都预 ...

老师,想问下,就是做胞内蛋白流式检测我是全程冰盒操作的,怕蛋白降解,这种情况是不是不能在室温孵育了?如果在4度孵育时间多长为宜呢?
发表于 2019-9-9 21:02:46 | 显示全部楼层
cocoa 发表于 2019-9-9 16:50
老师,想问下,就是做胞内蛋白流式检测我是全程冰盒操作的,怕蛋白降解,这种情况是不是不能在室温孵育了 ...

30分钟足够。
发表于 2019-9-9 21:04:59 | 显示全部楼层

谢谢老师,的确是够的,今天染的很成功
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