做流式增殖实验时容易犯的5个错误

niwanmao

细胞增殖以往经常通过以下三种方法检测：
（1）最直接的方法就是计算细胞数量，通过比较数量，确定实验处理是否能促进细胞增殖。
（2）利用放射性示踪剂3H-胸苷，使其参与DNA合成，从而利用其放射性确定增殖程度。
（3）利用3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (又称MTT)，MTT可被线粒体酶琥珀酸脱氢酶还原，加入有机溶剂就会形成MTT紫色甲瓒产物，可通过分光光度计检测。

细胞增殖曲线

然而，以上三种方法只能给出整体的生长情况，许多研究者更希望能够了解不同刺激条件下不同细胞群如何增殖，有些人甚至希望在特定分裂次数后将细胞分离出来，此时，就需要用染料稀释方法。该方法1994年首次由Lyons和Parish介绍，被引用很多次。这项技术中，细胞被CFSE等染料标记，此染料可随着细胞分裂而分配到子代细胞中，从而不断被稀释，所以通过计算峰的数量，可以了解细胞分裂了几代。

细胞分裂图

做流式细胞增殖实验时，需要避免的5个错误是：
1、不知道染料的质量如何
用于增殖实验的染料必须足够亮，能逐渐被细胞摄入并平均分配到子代细胞中。
CFSE及其衍生物可进入细胞并与胞内蛋白结合，亮度也强，符合上述特点，不过其缺点就是第一个24～36小时容易发生与增殖无关的荧光丢失。所以在解释早期增殖时需注意。
另一种染料就是亲脂性染料（如PKH26），这种染料可结合细胞膜，是CFSE非常好的替代品，然而这种染料对标记细胞的技巧要求较高，并且细胞大小对标记也有影响。与CFSE不同的是，该染料不会发生标记后荧光丢失，所以比较适合短期增殖检测。如果细胞需要固定，需注意避免使用有机溶剂。

2、忘记滴定染料
细胞示踪染料如果过量，可影响细胞功能和活性。因此，滴定染料浓度，确定效果最好同时又不影响细胞活性的最高浓度非常有必要。滴定可在一个固定的细胞浓度进行，以减少测试复杂性。

3、没有使用正确的对照
阳性和阴性对照都非常关键，仪器的优化也很关键。一旦染料浓度优飞黄腾达完成，电压的优化就很重要。

4、忘记检测细胞活性或粘连体
任何检测，确定活细胞非常重要。细胞凋亡时会丢失增殖性染料，所以通过细胞活性将这些细胞排除掉很有必要。同样，利用A/H或A/W移除粘连体对于确保增殖实验结果正确性也很关键。

5、没有收集到正确拟合模型的足够数量的细胞
收集的细胞太少，会导致增殖模型无法正确拟合。在很多流式实验中，细胞一般都是多比少好。