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改善流式细胞术检测免疫表型报告方式的策略

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发表于 2014-10-21 19:17:38 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞术现在已经成了分析免疫系统功能的基础工具。多色流式细胞术更是极大地扩大了免疫表型分析的应用范围。然而,除了正确选择对照以及方法学之外,标本的制备方法、数据的分析方法,也可影响结果,甚至会导致结果误读。

(一)标本制备方法
目前实验室大多利用密度梯度离心法制备标本,并且经常会将这些标本冻存起来。这种步骤虽然规避了全血样本的保存,但却会丢失50%以上的白细胞(主要是嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞),并且分离步骤的准确性及其分离得到的纯度不能保证,最重要的是,密度梯度离心获得的标本无法做到对原样本的准确计数。

因此,在临床实验室中,更多的是用全血样本,并且有大量数据表明,利用单平台法进行绝对计数可有效减少实验室之间的差异,例如HIV患者的CD4+细胞绝对计数,不仅可有效判断HIV病人治疗效果,而且单平台法可将实验室间误差减少约5%。还有CD34+干祖细胞绝对计数,采用单平台法(ISHAGE)可使36个实验室之间的CV值减少约10%。

(二)数据分析方法
目前分析免疫细胞最常见的方法就是用百分比,例如计算调节T细胞(CD4+CD25+CD127low)占CD4+细胞的比例,根据这种比例变化,然后总结出结论。这种百分比的比较方式,是建立在父级细胞群数量不变的基础上的,但实际上,如果前述的Treg占CD4+细胞的比例发生增高,是由于Treg细胞增多引起的,还是CD4+细胞减少造成的呢?

因此,Michael P Gustafson在《Strategies for improving the reporting of human immunophenotypes by flow cytometry》(Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:18)一文中指出,建议采用未经处理的样本(如全血)、利用绝对计数方法报告免疫细胞分析结果,可提供流式数据的准确性,并且能够更直接、客观、真实地反映出研究结果。

图1

图1


Figure 1 数据表示方式和标本制备方法可能影响免疫细胞分析结果。
A—— 27例胶质母细胞瘤患者(GBM)和40例健康人对照(HV)的T细胞、B细胞和淋巴细胞均以百分比表示(第一行)或绝对计数表示(第二行),可看到T细胞和B细胞在百分比上都有统计学差异,但实际上,如果看到绝对数,就会发现,T细胞确实存在差异,但B细胞的差异是由于淋巴细胞绝对数减少引起的,其绝对值原本是没有差异的。
B—— GBM患者初发(n=13)、治疗(n=12)、HV对照中NK细胞用占淋巴细胞比例(左侧图)、NK细胞用绝对数表示(中间图)、淋巴细胞绝对数(右侧图) ,NK细胞的百分比没有统计学差异,但如果用绝对数,就可以发现NK细胞和淋巴细胞均存在统计学差异,正是由于NK细胞和淋巴细胞绝对数发生同步减少,所以其百分比无法出现差异。

文献全文在线免费阅读:Click Here to Read Online
下载PDF(需2颗流星): Strategies for improving the reporting of human immunophenotypes by flow cytometry.pdf (510 KB, 下载次数: 22)
发表于 2015-11-23 05:57:14 | 显示全部楼层
那么能否请教下倪老师,从获得全血标本,到标记抗体,到上机,中间的具体步骤怎么操作呢?和以往的密度梯度离心有无重要的处理方面的不同之处?
 楼主| 发表于 2015-11-23 20:01:14 | 显示全部楼层
fdluzhufeng 发表于 2015-11-23 05:57
那么能否请教下倪老师,从获得全血标本,到标记抗体,到上机,中间的具体步骤怎么操作呢?和以往的密度梯度 ...

这个话题太大了。大部分内容我在站内其实以前都发过,你可以慢慢看过去。
裂解法比密度梯度离心法的优点就是:速度快、避免丢失珍稀细胞。
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