流式细胞术疑难解答（三）：其它

niwanmao

流式细胞术实验结果中，除了信号弱和背景荧光高外，还会碰到其它各种各样的困难。


1、交叉反应
你是否检查过抗体与你的标本之间的兼容性？例如针对小鼠的抗体用在大鼠实验中，效果就可能不一样。所以需要搜索文献，以确定克隆的交叉反应性。你可以在http://www.uniprot.org/上查找抗体之间的交叉反应性，但需要注意的是，即使两个物种之间的抗原存在高度同源性，也不能确保其交叉反应。
下面的PDF文件是biolegend公司的一个交叉反应列表，供参考。

在线免费阅读抗体交叉反应表：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzU2OHwxNTJjNzVkM3wxNzMyMjM0NTUyfDB8

下载（1颗流星）：
AntibodyCross-ReactivityChart101512.pdf (513.37 KB, 下载次数: 12, 售价: 1 流星)

2015-1-30 16:47 上传

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2、比较荧光素
你是不是发现PE荧光标记的抗体比FITC的要好一些？因为不同荧光素的亮度不同，所以比较不同荧光素标记的同种抗体检测结果就会造成误导。如果你要比较不同公司出的抗体质量，可以比较同种荧光素标记的抗体。
除了荧光素亮度，还有抗体的最优用量，对结果影响也很大。
还有，不同厂家之间的串联染料性能各不相同（亮度、信噪比），所以在更换串联染料时需要注意。


3、比较克隆号
除了荧光素差别，还需要注意克隆差异。不同的克隆号识别的是抗体不同的表位，而且结合能力也不同。因此，直接比较不同克隆号的性能也是行不通的。

克隆号之间的差异

4、结果不一致---批间差异
如果你在不同时间做的实验结果发生了变化，你就需要确认一下批号是否一样？如果你最近用了新的批号，那么就需要检查其抗体浓度是否发生了改变。有时候，相同的Test包装，但其推荐抗体用量从20 µL/test减到了5 µL/test。
一般如果换了一支新批号的抗体，最好进行批间比较，以确保抗体性能的稳定性。

5、结果不一致---标本的差异
你是否在检测人类标本？小鼠可以通过基因改造变得一致，但人与人之间的差异很大。所以你在得出实验结论前，需要增加你的样本量，以确保结果准确性。
还有，疾病状态、年龄、人种等都可以影响某个标记的表达水平。
不同批的细胞株也可以使得结果不同。