树突状细胞的诱导成熟方案及其流式检测

niwanmao

过继免疫治疗已用于治疗很多类型的癌症，而树突状细胞（DC）可诱导、调节这种免疫反应，因此逐渐成为肿瘤疫苗的佐剂。DC是一种强力的抗原递呈细胞，可识别、处理递呈外来抗原至T细胞。
在临床制备疫苗时，通常需要数百万的DC作为佐剂。DC本来就存在于外周血，但是外周血DC浓度非常低，所以收集外周血DC是不实际的。因此，通常用造血干细胞或外周血单核细胞来制备DC。

DC来源最常见的就是外周血单个核细胞（PBMC）。大量的PBMC通过白细胞分离术收集，并通过粘附、淘洗、免疫磁珠分选等方式，进一步纯化。这些单核细胞用GM-CSF和IL-4刺激后可生成DC，不过此时的DC是静止或未成熟的，被称为iDC。有些过继性免疫治疗使用iDC，但是，现在成熟DC（mDC）使用却越来越多了，因为与iDC相比，mDC表达更高水平的共刺激分子，产生更多的细胞因子，刺激细胞毒T细胞的能力更强。

mDC有以下特征：

高表达共刺激分子CD80、CD83、CD86、CCL21等
产生白介素-12p70（IL-12p70）的能力强，该因子是促使Th1反应的主要因子。

DC成熟可通过炎症信号如肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-1 beta（IL-1 beta）或细菌衍生物（如LPS），双链RNA、干扰素、前列腺素也可以诱导DC成熟。

常规的DC成熟诱导组合是IL-1 beta、IL-6、TNF-alpha和前列腺素E2，这种组合成熟的mDC虽然共刺激分子和迁移功能很强，但是IL-12表达水平低，因此有些人会加上IL-12p70。
但在临床上，现在主要用LPS和IFN-gamma组合。本文是发表在2009年J Immunother.上的文章，作者比较了LPS＋IFN-gamma、LPS＋IFN-gamma＋IL-1 beta、LPS＋IFN-gamma＋IL-1 beta＋TNF-alpha这三组在诱导mDC成熟上的效率，主要指标有：

ELISA法检测IL-12p70和IL-10的因子水平；
流式细胞术检测HLA-DR和CD80、CD83、CD86表达水平；
mDC的基因表达谱。

下表是三个组合诱导DC成熟共刺激分子的变化：

DC成熟时共刺激分子的变化

最后发现三组没有显著性差异。说明临床上只要用LPS＋IFN-gamma诱导DC成熟即可。

通过本文，其实大家可以从中学习到：

DC诱导成熟的方法学；
DC诱导成熟的指标检测；
流式细胞术检测DC成熟的指标及其变动程度。

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2015-3-27 16:36 上传

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niwanmao

pharm 发表于 2020-5-8 00:32
倪老师您好，我最近在从事树突状细胞的研究。如附件中的图片所示，很多文献在考察DC成熟的几个标志物时，都 ...

这里的百分比指的是DC细胞上的这个抗原的表达率。是通过按照对照设门之后，在实验组样本上读出百分比得到的。这里因为叠加在一起，所以没有看到Gate。

zy21318302

伲老师，我最近也在做这个DC，是小鼠骨髓来源的DC2.4，但是发现仅用LPS刺激（0.1ug,10ug,50ug/ml的浓度都试过），连续刺激两天，表面分子表达仍很低，抗体什么的都没有问题，请问是这个细胞有问题吗？

niwanmao

zy21318302 发表于 2015-3-31 19:53
伲老师，我最近也在做这个DC，是小鼠骨髓来源的DC2.4，但是发现仅用LPS刺激（0.1ug,10ug,50ug/ml的浓度都试 ...

你尝试用文中的LPS+IFN gamma方案试试。

yueliangchulail

这是我培养的DC的流式检测结果，好像分不开？

niwanmao

yueliangchulail 发表于 2018-12-10 16:02
这是我培养的DC的流式检测结果，好像分不开？

建议：
1、进行Fc阻断。
2、降低电压。
3、采用FMO对照依次确定每个通道的阴阳性分界位置

yueliangchulail

niwanmao 发表于 2018-12-12 10:14
建议：
1、进行Fc阻断。
2、降低电压。

谢谢! 需要另外设同型对照吗?

yueliangchulail

niwanmao 发表于 2018-12-12 10:14
建议：
1、进行Fc阻断。
2、降低电压。

我的是6色分析的，设置FMO对照，需要设置6组？

niwanmao

yueliangchulail 发表于 2018-12-12 14:45
我的是6色分析的，设置FMO对照，需要设置6组？

看你分析哪几个指标，如果6个指标都是分群不明显的，就得设6管。

yueliangchulail

niwanmao 发表于 2018-12-13 08:11
看你分析哪几个指标，如果6个指标都是分群不明显的，就得设6管。

哦哦 可以用微球来做FMO对照吗？因为细胞比较少啊

niwanmao

yueliangchulail 发表于 2018-12-19 14:59
哦哦 可以用微球来做FMO对照吗？因为细胞比较少啊

微球和细胞的性质相差很大，不能替代的。