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[流式protocol] 用PI、7-AAD、DAPI进行细胞死活鉴别

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发表于 2015-4-22 20:20:36 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞术检测时,死细胞非常容易导致非特异性染色,引起结果不正确,所以排除死细胞很关键。

死细胞的鉴别一般通过DNA结合染料排除,但所用染料浓度、时间远远低于细胞周期所用的浓度,并且不需要固定。

常用染料包括:
  • 碘化丙啶(propidium iodide,PI)
  • 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)
  • 7-氨基 - 放线菌素D(7-amino-actinomycin D ,7-AAD)
  • DRAQ7
  • SYTOX
  • 胺类染料



不过对于一些胞内抗原(细胞因子、转录因子),由于需要固定、破膜,所以上述染料中,除了一些胺类染料和新型蒽醌类染料CyTRAK Orange外,其它染料不再适合此类标本的细胞死活鉴别。


这里,我们只向大家讲解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法:
1. 用0.5ml 1×PBS重悬细胞。
2. 加入PI或DAPI或7-AAD,终浓度分别为PI(5 µg/ml)、DAPI(500-1000 ng/ml)、7-AAD(2.5 µM)
3. 加入上述染料后,尽快上机,一般不要超过5分钟。
PI检测通道:使用488 nm激发,用610/20 BP收集
DAPI检测通道:最好用355nm激发,用440/40BP收集;也可以用405nm激发,450/50BP收集
7-AAD检测通道:用488nm激发,用670/14BP收集
下图是用PI检测细胞死活的结果图:
2015-04-22_202049.gif


 楼主| 发表于 2015-4-23 09:16:17 | 显示全部楼层
曾经沧海 发表于 2015-4-22 22:59
谢谢倪老师专门的帖子!太感谢了!
还想多问一句
Hoechst33342(2ug/ml)的浓度染5min是不是也可行?我知 ...

5分钟内一般用来染死细胞的。
发表于 2015-4-22 22:59:43 | 显示全部楼层
谢谢倪老师专门的帖子!太感谢了!
还想多问一句
Hoechst33342(2ug/ml)的浓度染5min是不是也可行?我知道业内都是染1h来分Side population的,但是5min看起来只染上死细胞。(好像有一部分没有染上)
QQ图片20150422230116.png





发表于 2015-4-26 09:20:00 | 显示全部楼层
谢谢倪老师,我在一本流式书籍里看到的做杀伤实验时PI染色时半小时,浓度为3umol/ml,这样的话染色时间再加上上机时间前后估计2个小时,这会有很大影响吗?按照您资料里说的染色时间不超过5min且尽快上机。(染色半小时后会离心将PI洗去)
 楼主| 发表于 2015-4-26 10:58:34 | 显示全部楼层
gaga1989xl 发表于 2015-4-26 09:20
谢谢倪老师,我在一本流式书籍里看到的做杀伤实验时PI染色时半小时,浓度为3umol/ml,这样的话染色时间再加 ...

鉴别杀伤试验对细胞的杀伤效果吗?那我觉得还是最好用短时染色更好吧。你指的是什么书呢?
发表于 2015-4-27 08:35:47 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-4-26 10:58
鉴别杀伤试验对细胞的杀伤效果吗?那我觉得还是最好用短时染色更好吧。你指的是什么书呢?
...

是的,用培养后的T细胞对肿瘤细胞进行杀伤实验,肿瘤细胞双标CFSE和PI。书是华中科技大学出版,梁智辉,朱九武等主编的《流式细胞术基本原理与实用技术》,可能书年限也有些长了,知识更新落后了。
发表于 2015-4-30 10:03:48 | 显示全部楼层
谢谢倪老师!实验中常遇到此类问题,很有帮助。
发表于 2015-11-4 14:45:12 | 显示全部楼层
我们有个实验要用到胞内染色,但是该染料和死细胞、碎片的非特异性结合很强,影响结果,7-AAD等又适用,请问是要用CyTRAK Orange吗?但我看说明书这个染料也是与DNA结合,而且是用来区分有核与无核细胞的。
像我们这种要求怎么来做? 谢谢!
 楼主| 发表于 2015-11-5 15:12:03 | 显示全部楼层
yuemin5 发表于 2015-11-4 14:45
我们有个实验要用到胞内染色,但是该染料和死细胞、碎片的非特异性结合很强,影响结果,7-AAD等又适用,请 ...

可以考虑用商业化的、适合固定破膜实验的活细胞染料,那些染料的原理不是结合DNA,所以可以避免冲突。
发表于 2015-11-10 08:29:47 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-11-5 15:12
可以考虑用商业化的、适合固定破膜实验的活细胞染料,那些染料的原理不是结合DNA,所以可以避免冲突。 ...

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