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[流式protocol] 三种流式细胞术方法检测自噬

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发表于 2015-5-11 20:20:40 | 显示全部楼层 |阅读模式

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1、吖啶橙。
吖啶橙来检测细胞中的酸性囊泡,来反应细胞自噬程度。价格便宜,但特异性欠佳。
试剂配制和步骤见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-416-1-1.html

2、LC3-II。
LC3-II是自噬最重要的生物学标记,在自噬发生时位于自噬小体内。因此特异性高。与同型对照进行平均荧光强度(MFI)对比,确定自噬发生。

Jurkat和K562细胞的自噬检测

Jurkat和K562细胞的自噬检测


Jurkat和K562细胞分别以雷帕霉素、无血清培养、氯喹等因素诱导自噬后的LC3-II的MFI变化。

3、LysoTracker染料。
自噬时,相关细胞器会出现自噬流动,首先形成双层膜的自噬小体,然后与溶酶体融合形成自溶酶体。LysoTracker染料就是检测这些自溶酶体的数量变化。
LysoTracker Green以50 ng/ml在37℃与细胞孵育1小时后,然后以PBS洗涤,标记DAPI (200 ng/ml)区分细胞死活,最后用配备蓝色(488nm)和紫光的流式细胞仪检测。以平均荧光强度(MFI)确定自噬的发生。

protocol全文免费在线阅读:
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如需下载PDF(1颗流星):
Measurement of Autophagy by Flow Cytometry.pdf (257.85 KB, 下载次数: 74, 售价: 1 流星)
发表于 2015-11-4 17:07:38 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-10-14 14:02
大致看了下步骤,貌似就是用mitotracker跟踪线粒体的膜电位变化嘛,这个看荧光强度变化就感觉挺难做的。 ...

恩,但是在实验中,他必须通过加抑制剂来做出线粒体的变化,才能算出自噬的大概量,我觉得他最大的亮点就是提出了那个计算线粒体自噬的通量的概念,但是要做多种抑制剂联合作用或者诱导剂联合使用的话,就不太好进行定量分析了

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niwanmao + 1 感谢分享

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发表于 2015-7-10 11:12:47 | 显示全部楼层
再加上之前版主发的OFACS(细胞超声处理后的细胞器流式检测)方法就齐全了

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3764-1-1.html
发表于 2015-10-11 23:26:17 | 显示全部楼层
倪老师,我具体是想做线粒体的自噬,如果通过这种方法只能说明是细胞本身的一个总体的自噬情况,但是不能够针对性的只观察线粒体姿势的情况,请问有没有专门做线粒体自噬的流式相关技术呢?
 楼主| 发表于 2015-10-12 21:06:53 | 显示全部楼层
苏格兰白草莓 发表于 2015-10-11 23:26
倪老师,我具体是想做线粒体的自噬,如果通过这种方法只能说明是细胞本身的一个总体的自噬情况,但是不能够 ...

mitochondrial autophagy又称mitophagy,我没做过,但这篇文章非常好,相信对你肯定有帮助:http://www.tandfonline.com/doi/p ... 034403#.VhuwOdXvOM8

全文下载下来的话欢迎分享到这里:)
发表于 2015-10-12 22:56:28 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-10-12 21:06
mitochondrial autophagy又称mitophagy,我没做过,但这篇文章非常好,相信对你肯定有帮助:http://www.t ...

非常感谢倪老师引路,我先试试能不能把文章下下来,如果下载下来了,我非常愿意和大家分享学习
发表于 2015-10-13 18:54:50 | 显示全部楼层
@niwanmao 倪老师,已经找到这篇文献,我只是大概浏览了一下,没有细看,不敢妄加评论,先传上来给大家分享吧

New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.pdf

1.14 MB, 阅读权限: 20, 下载次数: 9

售价: 1 流星  [记录]

流式检测线粒体自噬

 楼主| 发表于 2015-10-14 14:02:04 | 显示全部楼层
苏格兰白草莓 发表于 2015-10-13 18:54
@niwanmao 倪老师,已经找到这篇文献,我只是大概浏览了一下,没有细看,不敢妄加评论,先传上来给大家分享 ...

大致看了下步骤,貌似就是用mitotracker跟踪线粒体的膜电位变化嘛,这个看荧光强度变化就感觉挺难做的。
发表于 2016-6-30 15:15:38 | 显示全部楼层
倪老师,想问一下染LC3II的话固定破膜剂可以用ebioscience的Foxp3 Fix/Perm kit吗?
 楼主| 发表于 2016-6-30 20:41:23 | 显示全部楼层
lisa-apple 发表于 2016-6-30 15:15
倪老师,想问一下染LC3II的话固定破膜剂可以用ebioscience的Foxp3 Fix/Perm kit吗?

可以试试的。
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