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[流式protocol] 流式定量检测Th1和Th17细胞

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发表于 2015-5-12 20:01:07 | 显示全部楼层 |阅读模式

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效应CD4+ T细胞以往被认为只是由Th1或Th2组成,现在认识到还有Th9、Th17和Th22。这些细胞的区别在于它们分泌的细胞因子:
  • Th1细胞分泌IFN-γ;
  • Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13;
  • Th9细胞分泌IL-9;
  • Th17细胞分泌IL-17;
  • Th22分泌IL-22。

需要说明的是,以上因子并非这些细胞所有因子,而是其中几个最有特征性的。

分泌细胞因子的免疫细胞在适应性免疫中起着中心作用,对这些细胞进行定量,有助于理解免疫反应。Th1和/或Th17细胞在一些疾病发病过程中有着重要作用,例如炎症性肠病、类风湿性关节炎和多发性结节性硬化等。对Th1和Th17细胞的定量,可为这些疾病和其它Th1和/或Th17相关疾病的研究提供重要信息。

流式细胞术检测人外周血Th1、Th17细胞有两种主要方法,一种主要是根据细胞表面标记,如CXCR3、CCR6、CD161,比较节省时间,但这些标记不是Th1、Th17特异性的,故容易导致比例增多,另一种则根据表面和胞内染色,通过体外培养刺激,促进细胞分泌细胞因子。我们这里讲的就是第二种方式。

本节中的protocol主要步骤是将人PBMC(外周血单个核细胞)分离出,然后标记碘化丙啶(PI)和吖啶橙(AO),然后以PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A刺激,接着标记CD3、CD4、CD8标记,最后标记胞内细胞因子,上机检测。

在流式中文网论坛上,经常会有站友问到PMA、离子霉素等的浓度,在此将protocol中的活化培养基配方单独提出来分享给各位FLOWER:
1、配制储存液

Brefeldin A, 5 mg/ml
将brefeldin A (Sigma)粉剂溶解于DMSO,配制成5 mg/ml储存液,分装成20μl一管,保存在-20℃可保存6个月。

Ionomycin, 0.5 mg/ml
将ionomycin (Sigma)粉剂用纯乙醇溶解,配制成0.5 mg/ml储存液,分装成20μl一管,保存在-20℃可保存6个月。

Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/ml
将PMA (Sigma)粉剂溶解于DMSO,配制成0.1 mg/ml 储存液. 分装成20μl一管,保存在-20℃可保存6个月。

2、配制活化培养基
将PMA、ionomycin和brefeldin A各取出一管,在180μl培养基中加入20μl 0.1mg/ml PMA(就是前面分装的一管),配成PMA稀释液。
取一支15ml离心管,加入4ml X-VIVO 15培养基,再4μl PMA稀释液、8μl 0.5mg/ml离子霉素储存液、8μl 5mg/ml brefeldin A储存液。
这样,终浓度分别为:10 ng/ml PMA, 1 μ g/ml ionomycin, and 10 μ g/ml brefeldin A.

提取PBMC、计数PBMC、刺激、表面和胞内染色等详细步骤点击下面图标,即可免费在线阅读PDF,无需下载。
Click Here to Read Online


如需下载PDF,需1颗流星:
Quantification of Th1 and Th17 Cells with Intracellular Staining Following PMA I.pdf (236.67 KB, 下载次数: 112, 售价: 1 流星)
发表于 2016-5-24 00:36:27 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-3-6 20:31
正常人就有一定比例的Th1、Th2、Th17,大约1%以内。

这个其实很难界定。比如说那些无刺激情况下不产生IFN-gamma,但刺激后产生IFN-gamma的细胞算什么细胞喃?
个人认为,4小时的体外刺激后IFN-gamma +的细胞才是真正的Th1细胞。

如果真的要做非刺激的,可以用检测转录因子来替代检测细胞因子。
发表于 2015-5-20 17:23:20 | 显示全部楼层
倪老师,有下面几个问题。
1、PMA+IONOMYCIN 刺激后,除了检测cd4 T中CD69表达看细胞是否已充分活化,是不是刺激后,通过看细胞的形态以及有没有产生克隆,就知道活化的情况。

2、倪老师,你这个是什么标本,正常标本,还是炎症的,IFN-GAMA可以这么高。羡慕!!
 楼主| 发表于 2015-5-20 17:51:00 | 显示全部楼层
liliqianyi 发表于 2015-5-20 17:23
倪老师,有下面几个问题。
1、PMA+IONOMYCIN 刺激后,除了检测cd4 T中CD69表达看细胞是否已充分活化,是不 ...

1、形态可能大概判断,但还是CD69是最权威的标准。
2、这是文章中的图,是人外周血标本,详细处理步骤参见全文步骤:)
发表于 2015-7-21 00:05:03 | 显示全部楼层
“将ionomycin (Sigma)粉剂用纯乙醇溶解”,可以用DMSO溶解吗,会影响刺激效果吗,说明书上是乙醇或DMSO
 楼主| 发表于 2015-7-21 19:07:05 | 显示全部楼层
77609439 发表于 2015-7-21 00:05
“将ionomycin (Sigma)粉剂用纯乙醇溶解”,可以用DMSO溶解吗,会影响刺激效果吗,说明书上是乙醇或DMSO ...

可以试试吧。
发表于 2015-11-2 10:12:50 | 显示全部楼层
倪老师,这几个试剂的储存液原则上-20℃可保存6个月,有没有实际操作,用的时间一般可以更久呢?         我相同的试剂盒操作方法,之前有做出来过,隔了一段时间,又不太好了。试剂的时间得有一年了,不知道是过期的原因还是?

还有PMA工作液10ng/ml,我后来做出来的,用的是200ng/ml,不知道大家实际操作的如何。试剂的配制确实很重要。
发表于 2015-11-2 10:33:43 | 显示全部楼层
本帖最后由 liliqianyi 于 2015-11-2 10:44 编辑

倪老师,这个是新鲜肝脏细胞刺激后染胞内因子,但是图形很不好看,做了补偿,但是效果不好,斜向上的箭头,是补偿的问题,还是一些碎片的问题,我没有染死活。这种情况,有什么操作可以挽救改善吗。

我想圈TCR+CD4+细胞群,另外也想看一下TCR+CD4-这群。第一幅图,我觉得是有TCR+CD4-这群,但是分的不是很开。TCR-Percp-cy5.5,CD4-pecy7.
FSC-A,_SSC-A_subset_cd8.PNG
FSC-A,_SSC-A_subset.PNG
 楼主| 发表于 2015-11-2 13:49:56 | 显示全部楼层
liliqianyi 发表于 2015-11-2 10:33
倪老师,这个是新鲜肝脏细胞刺激后染胞内因子,但是图形很不好看,做了补偿,但是效果不好,斜向上的箭头, ...

你这两幅图圈的都是CD4+TCR-嘛。
这种拖尾基本上都是非特异性染色引起,可考虑死活染料鉴别,其它没有办法。
发表于 2016-3-4 10:08:10 | 显示全部楼层
这个检测做临床的时候,真的是可重复性太差。

而且每次做的结果,都不一致。

真想把Th1、th2开到临床上来。

但是一直结果不理想。

有成功开展的吗?
 楼主| 发表于 2016-3-4 21:49:25 | 显示全部楼层
zhang4083 发表于 2016-3-4 10:08
这个检测做临床的时候,真的是可重复性太差。

而且每次做的结果,都不一致。

开到临床上就不能涉及到培养和刺激,而应该直接测,这样靠谱,重复性高。
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