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以PNH检测为例,谈谈如何进行流式实验设计

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发表于 2015-9-16 20:46:50 | 显示全部楼层 |阅读模式

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进行流式实验设计,尤其是一些稀有细胞的检测,例如ISHAGE方案检测CD34+干祖细胞、高灵敏度检测PNH红细胞和白细胞等,需要考虑众多因素。接下来,我们会以PNH检测为例,分三篇连载,依次讲解:
1、流式实验设计步骤和考虑要点。
2、Beckman Coulter平台PNH检测项目的仪器设置优化和维护
3、BD平台PNH检测项目的仪器设置优化和维护

开始任何一个检测项目或者实验都一样,首先需要考虑目标细胞群的生物学特点,例如这些细胞比例高不高,是否为稀有细胞(<1%)?目标细胞群是单纯的一系还是多系混合?是否需要对目标细胞进行分群处理?
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一旦确定好,我们准备采用什么分子(抗原)区分目标细胞(也就是设门)?用什么抗原来检测门内细胞的疾病相关性异常?是否需要活性染料或计数微球?
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确定好关键性抗原之后,进一步考虑这些抗原的结构特点是否会影响抗体/荧光素的选择?举个例子,如果你的实验需要检测负电荷、O-糖基化分子,如CD34糖基化形式,那么并非所有CD34抗体都适合检测所有糖基化形式,有些抗体可能只能结合特异性糖基。即使那些可结合所有糖基化CD34的抗体中,也有一些可能因为结合了负电荷荧光素(如FITC)而丧失了高亲和力。所以,在检测稀有CD34+细胞时,要实现可靠性,需要选择PE标记的CD34。


按照上述思路我们来设计PNH检测的实验方案
由于PNH红细胞检测敏感度要求高,所以需要用CD235a(Glycophorin A)设门。首先,我们选择了可结合CD235a所有结构形式的克隆,因为一开始我们用了CD59 FITC检测目标抗原,所以CD235a选择了PE标记。然而,很不幸的是,CD235a PE会造成很明显的凝集,稀释也无法缓解这种现象,将CD235a改为FITC标记、CD59改为PE后,这种现象就消失了。这里需要提一下的是,有些CD59 PE无法有效分离PNH II类和III类细胞,所以需要对一些商品化CD59 克隆进行试验,选择区分能力最好的克隆。

至于PNH 白细胞(粒细胞和单核细胞)的抗体组合,我们也测试了很多组合,最后选择CD15区分粒细胞,CD64区分单核细胞,详细见后续的连载二和三。

除了抗体组合的优化,正确的抗体滴定也很重要。实验中的染色步骤和方法也需要注意优化,例如要实现PNH红细胞高灵敏性检测,那么需要洗涤两次,获取数据前离心去上清要谨慎小心,设门时FSC和SSC要选择LOG模式。


以上是PNH实验设计的思路和摸索过程,其实,其它的科研、临床实验也都类似,你只有深入了解了你的实验目的和细胞性质、抗原特点,才能进行进一步摸索、优化。
明天和后天我们会继续讲解后面两部分:(Beckman Coulter平台PNH检测项目的仪器设置优化和维护、BD平台PNH检测项目的仪器设置优化和维护)。


本文作者:Andrea J Illingworth, Mariela Monreal, Elizabeth Stone, D. Robert Sutherland;内容编译:倪万茂


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发表于 2018-3-27 10:41:29 来自手机 | 显示全部楼层
难怪之前做预实验,红细胞做的不好,我们就是用的CD235a-PE
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