流式分选仪，你了解多少？

niwanmao

@Arcrain站友是流式中文网资深的热心站友，往往不言则已，言必惊人。前两天，在回答站友问题（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4821-1-1.html）时，十分详细地讲解了流式分选仪的性能指标，并穿插了不少分选的实用技巧，不收藏真是可惜了。

分选效率和分选纯度是选择流式分选仪很重要的性能指标。

分选纯度很简单，是你最后得到的细胞当中，有百分之多少是目标细胞。分选完了之后，立即再用分选得到的细胞上样一检测就可以知道了。

分选效率：一般所说的分选效率应该是指分选门内有百分之多少的细胞被仪器分选出来。这个与你设定的分选模式、跑样速度、仪器液滴震荡频率、目标细胞的百分比、电子系统性能等都有关系。

分选模式影响很大

富集模式下，只要有符合要求（分选门里的细胞）的细胞，那么不管是不是同时还存在非目标细胞，仪器都会将其分选出来。（通常可以用于分选很低比例的细胞，保证得到足够数量的目标细胞，这时纯度会有所降低，但分选顺利的话依然是能够达到到90%，95%甚至97%纯的，当然与样本有关）。
纯度模式下，一个液滴中只有目标细胞且没有非目标细胞，而且离这个目的细胞前后一定范围（可以设定）没有非目标细胞，它才会被分选。通常都是用纯度模式。
单细胞模式就更严格了，目标细胞必须位于液滴中间位置，前后液滴没有其它细胞，才会被分选。一般用于多孔板单克隆分选，长单克隆的。
主要是这三种模式，还有一些介于这三种之间的组合。

液滴震荡频率

就是每秒钟产生多少个液滴。如70um的喷嘴一般能到80KHZ左右，就是每秒钟8万个液滴。显然，跑样速度不能高于这个数，否则就不是一个液滴一个细胞了。当然，低于这个数值的跑样速度也不能就一定保证一个液滴一个细胞，因为细胞间的间距是随机的，还会粘连，因此有空液滴，也有两三个细胞一个在一个液滴中的。另外，仪器一般会“看”前、中、后三个液滴，根据你的分选模式做出分选决定。（如，纯度模式下，细胞靠近液滴上端，且后一个液滴没有非目标细胞，仪器会把这两个液滴都分选出来，以保证一定能得到这个细胞。因为液滴断裂时这个位置的细胞也可能位于后一个液滴中）。跑样太快了，被仪器丢弃的细胞就会多，分选效率就下来了（但分选速度仍会增加，看你的取舍了）。告诉你一个实用的经验，

一般情况下，跑样速度控制在震荡频率的1/4-1/3能较好保证效率

（当然，你一定要自己多观察。目标细胞比例太低，分选效率也会降低，这时要保证效率就要减速了。不同仪器电子系统性能不同，同等情况下效率也不相同，这些都需要操作者观察积累经验，根据具体样本和实验目的来操作。）

分选的回收率

就是最终你得到的目标细胞占样本中目标细胞的百分比。回收率跟分选效率不太一样，并不是仪器显示分选出了多少个细胞，你就得到了多少个细胞，实际得到的细胞数量要比它少。例如，细胞如果死亡严重会让你损失很多细胞。有的仪器容易分选出空液滴，实际得到的细胞数量偏离仪器显示的分选细胞数目更远，各种因素加起来，可能你得到的细胞数目还不到仪器计数的1/3，甚至更低。

所以细胞活性也很重要，除非你不管死活。用不同尺寸的喷准分选不同大小的细胞，除了防止堵塞，另一个目的就是提高细胞活性。细胞在流式上跑样时是会受到损伤的（不要听厂商销售说的分选对细胞没有影响。）。有的分选仪就优化了对细胞活性的保护，可以非常好的保证脆弱细胞的存活。（例如，据我所知，脆弱的神经干细胞都能有90%的存活，其它条件当然也要配合才行，这玩意可是放到PBS里就会死的。）不同尺寸的喷嘴对应的液滴振荡频率不同，能达到的分选速度有很大差异。尺寸越大，鞘液压力越低，液滴频率越低，最大分选速度就越低，但细胞活性越好。

分选速度

分选速度也是个重要的性能指标。了解了液滴频率，其实就可以明白，物理规律都一样，不同仪器能达到的液滴频率也基本差不多，只要不是太差，同等情况实际分选速度不会相差很大。（高分选效率和回收率的仪器当然可以适当提高分选速度）。


综合各方面性能来考虑，不同分选仪差别是蛮明显的。

96孔板分选，不用管细胞大小，就用100um或以上的喷嘴吧，单细胞模式分选。这个分选又基本不要求速度。

液流稳定性和落点问题，仪器机械性能当然很重要，这个改变不了，但一般都是非常可靠。仪器所处环境温度波动会有影响较长时间的实验。喷嘴是否有瑕疵，调节的分选液流质量，鞘液罐是有点否漏气，过滤器是否有气泡，喷嘴是否干净，分选模式是否合适这几个方面可以考虑。

只要各个地方都没有问题，分选仪是会非常稳定的！

Arcrain

避免细菌污染：
（1）仪器液路管道无菌。Aria可以执行Aseptic Sort Preparation来进行，这个程序就是用NaClO（BD卖的那个FACS Cleans清洗液）清洗、浸泡管路来除菌，效果可靠。（鞘液过滤器不能通过次氯酸钠溶液！）。其它机器如果没有这种深度清洗程序，那就自己用次氯酸钠溶液（1%左右，可以的话加热到45°左右，感觉温热而不烫）作为鞘液，开液流跑上30min，再用无菌水跑30-60min，可以彻底清洗管路。注意如果有滤器的话，要把它取下来短接，否则它会残留大量NaCLO，很难清洗干净，分选时杀死细胞。本方法专治一切管路问题，治不好就要更换液路管了。
（2）更换鞘液过滤器。一般都是白色塑料的囊式过滤器，0.22um的，最好当然是用0.1um的。用的时间长了，可以发现颜色会变的有点发黄，一般6个月左右要更换，鞘液本身干净的话，可以用得长一些。管路如果长过菌，清洗之后，换新的过滤器，旧的一定不要再用。（厂商很黑心，过滤器要价超过市价5-7倍不是问题，而在国内市场上自己还买不到......）
（3）制备的鞘液（一般都是PBS）要确保干净。即一般要以0.22um过滤，最严格的要求是用0.1um过滤三次。我是直接用超纯水稀释买来的本身已经过滤无菌的PBS浓缩液，没有问题。
（4）在无菌超净台里灌鞘液。一切操作在超静台里进行。鞘液罐用洁净水冲洗，再灌入75%乙醇，盖好密封，晃动，放上1小时。然后倒出乙醇，罐口向下放置15分钟，再正过来放置，开超净台紫外灯1小时，这时乙醇也都已经干干净净了，这一步也可以用确保无菌的水冲洗掉鞘液罐残留的乙醇来快速完成。
如果鞘液罐本身可以（我是说可以方便的）进行高压灭菌，那就更方便了，灌好鞘液密封，往高压灭菌锅一扔，第二天直接用（当然温度要到室温）。
（5）样本管、接收管打开时，千万不要对着它呼吸！！
（6）在分选前，进样区域、分选仓及其上面等相关区域少量喷洒点75%乙醇，（根据你的仪器来）。自然挥发后进行分选，如无必要，不要过多的打开分选区域。
（7）最好是在细胞间空气净化的环境下分选。（十万级、万级或者更高洁净度的房间）
原则就是保证大环境无尘，微环境无菌，鞘液绝对无菌。
分选时边上不要围上一堆人，不要走来走去，不要喷口水.........分选时会产生大量气溶胶，里头是有来自样本的癌细胞，又被周围的人吸进去的话.........围观人群瞬间跑光。

我们这里常分96孔板，不加抗生素养上一周也不会污染。大量富集也可以做到长期不加抗生素培养。
好了，以上介绍了一些以前摸索出来的方法，很彻底了是不是？大家应该不会再有什么问题了吧。
至于说仪器里头的空气，以上工作做好了，不会让你的样本染菌的。有的仪器分选仓空间大，但分选仓也会配上臭氧紫外灯的，分选前开个15min左右就好。

mingxu95

我没做过细胞分选，但是一直有个问题困扰着我，分选出来的细胞从仪器取出时是如何避免污染的呢，毕竟空气中还是有菌的。另外，仪器内存放细胞收集器的空间是如何灭菌的？还望指教，谢谢。

niwanmao

mingxu95 发表于 2015-12-8 16:56
我没做过细胞分选，但是一直有个问题困扰着我，分选出来的细胞从仪器取出时是如何避免污染的呢，毕竟空气中 ...

需要@Arcrain  站友出来帮忙回答一下。

据我所知，似乎管路是用乙醇跑过消毒的，然后整个房间用紫外线灭菌。

lizhirong2002

其实是很难做到无菌分选的

happyeday

我们的仪器是moflo，过滤器就像柱式滤纸。如果出现污染，取出过滤器，高压一下，然后放到超净台，吹干。是可以再利用的。管路清洗方法同上。

gaocx

Arcrain 发表于 2016-1-19 16:59
避免细菌污染：
（1）仪器液路管道无菌。Aria可以执行Aseptic Sort Preparation来进行，这个程序就是用NaCl ...

能否请教一下前辈，鞘液过滤器应该在哪里购买？