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破膜剂的秘密(一)

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发表于 2016-5-26 21:21:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式染色中,最难的是破膜,了解破膜剂的秘密,能够更好地进行胞内染色。

为什么要进行破膜?
很简单,就是希望研究细胞内部的蛋白分子,正常情况下,荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜,只能在细胞膜上打出足够大的孔,才能使抗体进入细胞内。
一般,破膜主要分为以下几步:
(1)用醛类(多聚甲醛、甲醛、戊二醛)或有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)固定或稳定细胞膜。
醛类在固定的同时可以增加细胞渗透性,但还不足以使抗体进入。但如果用有机溶剂固定,那么后续的破膜就不需要了。
(2)用去污剂或溶剂破膜。
(3)将细胞与胞内抗体或标记物孵育。

我什么时候需要用去污剂?
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什么是去污剂?工作原理是什么?
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figure1.jpg


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 楼主| 发表于 2016-5-31 19:44:07 | 显示全部楼层
木石织梦 发表于 2016-5-31 11:40
倪老师,您说(1)洗液:在PBS洗液中加入低浓度的去污剂可以减少一些非特异性染色,这里的低浓度是浓度多少 ...

这个方法在免疫组化上用的比较多,流式上倒还没用过,可以试试看:
浓度为 0.3% Triton X-100或 Tween 20
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发表于 2016-5-27 09:27:47 | 显示全部楼层
去污剂我们常用tween20,还有其他的吗,请倪老师再指教一些!
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 楼主| 发表于 2016-5-27 12:26:11 | 显示全部楼层
磊子-梦醒十分 发表于 2016-5-27 09:27
去污剂我们常用tween20,还有其他的吗,请倪老师再指教一些!

第二部分会讲。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2016-5-30 15:15:18 | 显示全部楼层
谢谢楼主  
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发表于 2016-5-31 11:40:39 | 显示全部楼层
倪老师,您说(1)洗液:在PBS洗液中加入低浓度的去污剂可以减少一些非特异性染色,这里的低浓度是浓度多少算低浓度?
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发表于 2016-6-6 09:14:30 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-5-31 19:44
这个方法在免疫组化上用的比较多,流式上倒还没用过,可以试试看:
浓度为 0.3% Triton X-100或 Tween 20 ...

哇哦,倪老师好厉害~谢谢你~又涨姿势了~
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发表于 2016-6-6 14:49:05 | 显示全部楼层
之前在测细胞内游离钙浓度的时候,使用过 0.3%Triton X-100作为破膜剂,测量最大荧光强度。然而结果并不理想。很多细胞在加入Triton X-100后都没有了荧光。

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组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2016-6-6 15:01:34 | 显示全部楼层
FM867小考拉乔娜 发表于 2016-6-6 14:49
之前在测细胞内游离钙浓度的时候,使用过 0.3%Triton X-100作为破膜剂,测量最大荧光强度。然而结果并不理 ...

小考拉说的这点其实很重要。无论什么方法破膜,一定需要用预期的阳性对照先行验证,确保该破膜剂对你的检测结果无影响。感谢分享。
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发表于 2016-6-8 16:58:07 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-6-6 15:01
小考拉说的这点其实很重要。无论什么方法破膜,一定需要用预期的阳性对照先行验证,确保该破膜剂对你的检 ...

如果不破膜,如何设立阳性对照呢?不太明白
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