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细胞凋亡检测,流式如何做到全覆盖?

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发表于 2016-8-23 20:31:52 | 显示全部楼层 |阅读模式

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凋亡,又叫程序性细胞死亡,是正常发育和人体细胞平衡的一种精细调节方式。凋亡与细胞坏死不同,后者是一种突发性的细胞死亡,非生理性的。
如果发生凋亡调节机制的异常,通常会导致癌症、自身免疫性疾病或退化性疾病。

凋亡在形态上主要表现为细胞皱缩、细胞渗透性增高、膜不对称性改变、染色质浓缩、DNA片段化、细胞出泡等,发生凋亡的细胞最后通过巨噬细胞胞吞作用清除。

没有一个指标可以明确细胞死亡的性质,因此,利用流式细胞术的多参数能力,可在一个样本中同时进行多种指标检测,揭示细胞死亡的性质。

从凋亡的早期、中期到晚期,在流式上都有相应的方法可用枟检测。

1、早期凋亡:
线粒体膜电位

JC-1是一种广泛使用的线粒体膜电位检测阳离子染料,它可进入带负电荷的线粒体内聚积形成聚集体,并488nm荧光激发,发出以红光为主的光谱,故在FL1/FL2散点图上,位于双阳性区域(见下图左侧小图)。在凋亡早期,线粒体膜电位会发生下降,此时,JC-1解离为单体,发出绿光,故此时在FL1/FL2散点图可看到一类FL1增强而FL2明显下降的细胞(见下图右侧小图)。详细protocol参见论坛:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3549-1-1.html
Figure-1.jpg



DiIC1(5) (1,1’3,3,3’3’-hexamethylindocarbocynanine iodide)是另一种阳离子线粒体膜电位染料,635nm激发,发红光,当线粒体膜电位降低时,可出现荧光强度降低。DiIC1(5) 通常在APC通道检测,所以比较容易与其它指标一起检测。
MitoTracker是另一种商品化线粒体膜电位探针,488nm激发,发红光,主要在PE通道检测,同样在膜电位降低时荧光强度发生降低。


2、中期凋亡:
(1)Caspase检测
细胞内蛋白酶的级联活化,是凋亡的一个重要性标志,这些蛋白酶主要是caspase。caspase开始以非活化的pro-caspase状态存在,当凋亡发生时,可被剪切成活化状态。活化状态的caspase酶可使没有荧光的caspase底物发出荧光。
目前检测的caspase种类主要是3和7,当然,1、2、8、10、11、12、13也有,在此不详述,参见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html
下图是Jurkat细胞用staurosporine处理后诱导的凋亡增多,可见caspase-3底物荧光增高。
屏幕快照 2016-08-23 下午7.18.33.jpg


详细方法参见论坛:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-192-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3111-1-1.html


(2)膜渗透性分析
一些单聚体染料,例如PO-PRO(405nm激发)、YO-PRO-1(488nm激发)、TO-PRO-3(635nm激发)等,可透入凋亡的细胞膜,结合只能染死细胞的染料(例如PI或7-AAD等),就可以区分出凋亡和坏死。
如下图,右下象限是凋亡,右上象限是坏死。
屏幕快照 2016-08-23 下午8.04.57.png


(3)膜对称性分析
随着凋亡的进行,膜对称性开始丧失,磷脂酰丝氨酸(PS)一般位于活细胞膜内测,对称性的消失意味着PS随膜翻转而暴露于膜外侧,从而可被Annexin V检测到。不过Annexin V的结合依赖于钙离子和镁离子,所以你在染色缓冲液中记得要加入这两种离子。
Figure-2.jpg


3、末期凋亡:
(1)细胞周期测SubG1峰,可使用PI、7-AAD、Hoechst33342等染料。
详细方法参见:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3496-1-1.html

(2)TUNEL分析
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-dUTP标记,主要是将TdT掺入断裂DNA的末端,实现检测末期凋亡。
apobrdupos.gif


详细protocol参见:
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-198-1-1.html

发表于 2018-4-19 16:01:29 | 显示全部楼层
最近做了线粒体膜电位的JC-1,早鲷晚凋的Annexin V/PI,看过老师的讲解后打算再做caspase检测
发表于 2018-7-3 16:01:46 | 显示全部楼层
老师您好,请问为什么 实用流式细胞术彩色图谱上写的caspases-3是早早期凋亡,而本文中提到是中期凋亡呢。
 楼主| 发表于 2018-7-4 08:15:47 | 显示全部楼层
418786804 发表于 2018-7-3 16:01
老师您好,请问为什么 实用流式细胞术彩色图谱上写的caspases-3是早早期凋亡,而本文中提到是中期凋亡呢。 ...

你看一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html 帖子中的这张模式图就了解了。
发表于 2018-7-4 12:28:11 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-7-4 08:15
你看一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html 帖子中的这张模式图就了解了。 ...

谢谢老师,已学习
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