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〖给新手的PPT〗流式细胞术介绍

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发表于 2016-10-25 19:38:15 | 显示全部楼层 |阅读模式

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经常发进展和进阶资料,也得照顾一些新手,这不,今天发一篇30多页的PPT,来自新南威尔士的Rob Salomon的Introduction To Flow Cytometry,内容挺全,从流式的概念到荧光、补偿、分选,都介绍到了,尽管不细,但作为给新手们的一个入门读物还是不错的。

下面开始吧,标题页跳过,直接来正文。首先,看流式细胞术单词flow cytometry的含义,包含了流动的、细胞、测量等意思。
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流式细胞术检测需要三个东西:
1、单细胞悬液(如果是组织标本需事先通过物理或酶法解离)
2、荧光探针标记的抗体(或通过间接标记)
3、流式细胞仪
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流式细胞仪工作原理:通过检测光信号,收集细胞的物理学参数和相关表型参数
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流式细胞仪内部包含液路、光路、电路等(当然,软件其实也非常重要)。
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通过流式,我们看到了哪些信号?一个是在一定大小范围内可反映细胞大小的前向散射光(FSC)、一定程度上可反映细胞内颗粒度的SSC,还有一类就是荧光信号,包括了FITC、PE、APC、GFP等等。
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通过常见的FSC/SSC散点图理解一下这两个物理参数的含义。
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利用荧光素染料或者荧光标记的抗体,可检测各类蛋白(包括细胞表面和胞内的抗原)、RNA、DNA、DNA合成情况、染料外排(主要是干细胞)、细胞器活性、pH值变化、蛋白相互作用、细胞分裂等等。
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荧光染料之所以能够发出荧光,是因为荧光分子被一定波长的激光激发后,能量提升至激发态,然后激发态荧光分子会释放出这部分能量,表现为光子,被检测器检测到。
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如何选择荧光素标记的抗体呢?首先得看这种荧光素标记的抗体有没有,其次荧光素亮度,接着看激发光源波长和发射光检测器的波长范围,最后看同一管里面的其它抗体或荧光素是否适合搭配。
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选择荧光素还需要注意与其它抗体之间的补偿情况,因为荧光素发出的光都是有一个范围的,所以不可避免与附近通道的荧光存在光谱重叠现象,例如FITC和PE,为此,需要从通道中减去漏进来的光,使其反映真实的荧光强度,这就是调节补偿。
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我可以用多少种荧光素呢?大多数流式用的是1~3色,一般表型检测用6~8色,复杂的方案用11~12色,更高的用17色甚至更多。
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然而,随着单管中荧光素数量的增多,数据就会越来越复杂,越来越难分析。
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流式结果的展示有多种图形,例如下面展示的是散点图、密度图、等高线图、直方图。
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流式细胞术最常见的用途包括:
表型分析(包括科研的淋巴细胞亚群和临床免疫分型等)
凋亡和细胞死亡
细胞周期、细胞分裂和DNA合成
转导、转染情况
细胞跟踪(主要是CFSE和PKH等细胞增殖)
小颗粒分析(例如现在的外泌体)
功能分析(如钙流、基因表达、染料外排、线粒体膜电位等)
水生生物和微生物鉴定
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为什么要使用流式细胞术?
1、快速获取(1秒钟可以获取3000~20万个事件,20万个我个人倒是没见过,不知道是不是那些声波聚焦的仪器?)
2、可实现单细胞分析。
3、结果可定量。
4、多参数分析。
5、统计学相关性好。
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普通流式和图像流式之间的对比,所谓图像流式就是在获取常规流式那些荧光信号的同时,还对细胞进行拍照,尽管照片比较模糊,但是可以将细胞形态和荧光结合起来看,这类仪器目前偏贵。
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流式再深入一些,就是分选了,分选就是你看到什么就可以把它分选出来,这方面的内容PPT里面就没有深入介绍了。
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以上的图片为了便于快速浏览,降低了图片质量,如需看到高清质量的图片,请点击下面的”在线阅读“按钮,在线高清查看(文件800多K,请打开后耐心等待加载,建议用Google Chrome浏览器):Click Here to Read Online
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发表于 2016-11-1 08:52:57 | 显示全部楼层
流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析,染料外排(主要是干细胞)。那么染料外排从生物学角度是怎样理解的?
 楼主| 发表于 2016-11-1 18:29:48 | 显示全部楼层
clz281 发表于 2016-11-1 08:52
流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析,染料外排(主要是干细胞)。那么染料外排从生物学角度是怎样理 ...

干细胞对Hoechst染料的外排,提示了干细胞自我保护的一种功能,可防止在用药时对干细胞的一种杀伤作用。
发表于 2016-11-3 08:56:14 | 显示全部楼层
clz281 发表于 2016-11-1 08:52
流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析,染料外排(主要是干细胞)。那么染料外排从生物学角度是怎样理 ...

由于干细胞对器官的更新非常重要,所以它当然具备非常强大的细胞膜泵功能以避免有害物质的入侵。已知某些干细胞对罗丹明123和Hoechst 33342具有特殊的高效排出功能。Hoechst 33342可结合至DNA的A-T富集区域。该染料可被紫外光激发(最大激发波长395nm),发出蓝光(最大发射波长450nm)。然而,当细胞发生凋亡或染料浓度增高时,发射波长可向红光区域移动。这种特性也可用来鉴定突变的干细胞。
       后来,相关文献上也查到一点点信息。
发表于 2016-11-3 08:57:09 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-11-1 18:29
干细胞对Hoechst染料的外排,提示了干细胞自我保护的一种功能,可防止在用药时对干细胞的一种杀伤作用。 ...

谢谢站长的指点
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