FITC/PI凋亡检测这个图有什么问题？

2005

我用的BD的FITC/PI双染试剂盒，检测肾癌贴壁细胞的凋亡，目前出现以下几个问题：
1. 在FL1/FL2图上，FITC单染细胞比未染色的细胞出现了明显的向右侧偏移，上图中没有单染的图
2. FITC单染细胞荧光补偿较小时，细胞不能完全囊括在3，4象限，补偿调大后，部分细胞则压在了x轴上，如何解决？
3. 3，4象限的细胞间没有明显分群，如何设置十字门呢？我自己设置的十字门后，Q3象限细胞比例太高，什么问题？
4. 我的这几种处理之间，各个象限的比例差异很小，能否说明我的处理因素（促凋亡，抑制凋亡）有效？

niwanmao

2005 发表于 2016-11-9 22:13
我又重复做了两次实验，还是之前的肾癌贴壁细胞，这两次的结果是这样的，请问这两个图可以设置十字门吗？ ...

可以的。从这里看，抑制凋亡有一定作用。但光凭一次看不出是否有统计学差异，建议重复三次以上。

ps654321

你设门就不应该用双阴性设门，你的双阴是指未双染的细胞吧？为什么不上单染图

niwanmao

贴壁细胞做Annexin V太难了，不知道为什么不做其它凋亡指标，例如线粒体膜电位或caspase家族。
从图上看，Annexin V的分群很不清楚，门确实很难设，我个人倾向于如下图的设门位置：

2005

ps654321 发表于 2016-11-9 20:43
你设门就不应该用双阴性设门，你的双阴是指未双染的细胞吧？为什么不上单染图 ...

这是我第一次做流式细胞的图，单染的做了但是没有存，fitc单染的图与上图中对照组的3，4象限很相似，完全不分群，pi单染的还好，位于1，4象限，并且能够分群

2005

niwanmao 发表于 2016-11-9 21:01
贴壁细胞做Annexin V太难了，不知道为什么不做其它凋亡指标，例如线粒体膜电位或caspase家族。
从图上看，A ...

我又重复做了两次实验，还是之前的肾癌贴壁细胞，这两次的结果是这样的，请问这两个图可以设置十字门吗？位置该怎么选？我的处理（促凋亡，抑制凋亡）有意义吗？

ps654321

还是倪老师一针见血。你后面做的就好多了。促凋亡总共才14%，而且你对照组凋亡就有11%。。。。。。有条件是否换个方式或者处理细胞的时候注意些？
另促凋亡作用是否该加量？

2005

ps654321 发表于 2016-11-10 17:04
还是倪老师一针见血。你后面做的就好多了。促凋亡总共才14%，而且你对照组凋亡就有11%。。。。。。有条件是 ...

好的，谢谢

轩辕河图

分析了一下这个实验案例，感觉第一次做的样本 Annexin V 就没有染好，后两次样品制备有进步但是细胞损伤还是有一些。至于组间趋势不明显建议可以适当饥饿细胞以促进凋亡。

轩辕河图

确实如倪老师所说，贴壁细胞用Annexin V & PI方案不容易做。