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[流式protocol] 〖权威Protocol〗Annexin V、PI双染区分凋亡和坏死

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发表于 2016-11-14 19:49:32 | 显示全部楼层 |阅读模式

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〖背景〗
正常细胞膜由脂质组成,但膜的内侧和外侧却并不对称,脂质中有一种叫磷脂酰丝氨酸(PS)正常情况下只分布在膜内侧,当发生凋亡时,膜不对称性消失,PS就暴露在细胞膜外侧。Annexin V是一种36kDa的钙离子结合蛋白,可与PS结合,从而可以检测出凋亡细胞。
但是事情还没完,因为坏死的细胞膜是被破坏的,所以Annexin V也进入胞内会结合上去,这时怎么办呢?
不用怕,同时标记一个碘化丙啶(PI)即可,因为PI只能进入坏死的细胞,而无法进入凋亡的细胞。
屏幕快照 2016-11-14 下午7.39.42.png
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流式中文网译自冷泉港Protocol。doi编码:10.1101/pdb.prot087288

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发表于 2016-11-18 03:49:46 | 显示全部楼层
老师,我觉得PI+,FITC-这种细胞指的是细胞膜受损的细胞。因为PI不光能与DNA结合,而且还能与细胞质中的RNA结合。PI阳性的原因是PI与细胞质中的RNA结合了。为了减少这种假阳性可以把细胞固定随后加入RNase。具体方法可以参考这篇文章【Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death】
 楼主| 发表于 2016-11-18 07:48:03 | 显示全部楼层
zhouweiwei 发表于 2016-11-18 03:49
老师,我觉得PI+,FITC-这种细胞指的是细胞膜受损的细胞。因为PI不光能与DNA结合,而且还能与细胞质中的RNA ...

是细胞膜被破坏的细胞,但是细胞膜被破坏、足够是PI能够进入时,我觉得无论是染RNA还是DNA,都可以证明细胞的死亡。

发表于 2016-12-2 14:27:05 | 显示全部楼层
倪老师,请问正常人骨髓单个核细胞凋亡有多少呢?我用艾森的机器、Annexin V/PI测的大概是1%左右,不知道是真正的凋亡还是假阳性,郁闷啊!
 楼主| 发表于 2016-12-2 20:33:40 | 显示全部楼层
jieam2007 发表于 2016-12-2 14:27
倪老师,请问正常人骨髓单个核细胞凋亡有多少呢?我用艾森的机器、Annexin V/PI测的大概是1%左右,不知道是 ...

自然凋亡率的影响因素挺多的,1%应该算挺低的啊。
发表于 2016-12-3 23:49:34 | 显示全部楼层
倪老师,你有做过正常骨髓的凋亡吗?或者有这方面的文献吗?我现在做的有点晕啊,之前用AV/PI法检测得出1%的结果,但不知道是真正的凋亡还是假阳性,现在试试JC-1,不知道能不能有点眉目
 楼主| 发表于 2016-12-4 11:25:46 | 显示全部楼层
jieam2007 发表于 2016-12-3 23:49
倪老师,你有做过正常骨髓的凋亡吗?或者有这方面的文献吗?我现在做的有点晕啊,之前用AV/PI法检测得出1% ...

没有做过,以前研究生的时候做的是细胞株的,1%属于很低了,从细胞群分布可以看是真是假,不管真假,都可以算作几乎无凋亡了。
发表于 2016-12-24 00:11:08 | 显示全部楼层
用Annexin V 与 7-AAd做凋亡,ebioscience的protocol说加入annexin V室温孵育10-15min后“wash cells in 1x binding buffer and resuspend in 200 ul of 1x binding buffer” 是指的染完Annexin V需要洗一遍细胞再加7-AAD吗?做了两次,都没有任何凋亡,单阳管也没有染出来,后来有人说 Annexin V与7-AAD要一起加,不能洗,要避光,冰上操作。 不知ebioscience的protocol是否正确? 谢谢!
 楼主| 发表于 2016-12-24 16:30:07 | 显示全部楼层
zhuangrui911 发表于 2016-12-24 00:11
用Annexin V 与 7-AAd做凋亡,ebioscience的protocol说加入annexin V室温孵育10-15min后“wash cells in 1x ...

是Annexin V没染出来还是7-AAD没染出来?
发表于 2016-12-26 01:13:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-12-24 16:30
是Annexin V没染出来还是7-AAD没染出来?

都没染出来。。。  不知道是哪一步出了问题
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