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[图片] 〖破案〗这类细胞CD4表达强度比阴性群还低,怎么回事?

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发表于 2016-11-15 20:36:39 | 显示全部楼层 |阅读模式

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用“破案”的形式,看看我们流式界隐藏在全国各地的福尔摩斯或者柯南究竟有多少?
==2016年11月15日案件==
来看下面这个图,是从一个多色实验中截取的一张CD69/CD4散点图,从这张图中,我们看到中间密度最大的是CD4阴性细胞群,但在阴性细胞下方,还有一类细胞CD4表达强度比阴性群还低,这是怎么回事?请跟贴回答。
屏幕快照 2016-11-15 下午8.26.48.png


==2016年11月16日罪证陈列&新发案件==
看来咱们的FLOWER中隐藏了许多福尔摩斯,案件很快就破了。确实,这就是多色实验中(常见于8色、10色等),相邻通道补偿过大,在另外的通道上就会显示成这样。
上面这个图的原因就在于CD4/CD57的补偿过大:
r1.jpg


将CD4/CD57的补偿调节正确后,CD4/CD69的显示就正常了。
r2.jpg


案件是破了,但是大家有没有发现,在细胞群周围空白处,出现一些散在的点(如上图红色箭头处),这又是什么?真是一波刚平,一波又起。大家继续来猜猜。

==2016年11月17日破案结果==
上图中红色箭头所指的散在信号在调节正确补偿后,仍然存在,并且其它角落也都存在类似信号,我们平时只是知道不是正常的,会去排除掉它们,但来源,却不甚清楚,NIH中心的Pratip K. Chattopadhyay在PPT《Forensic Flow Cytometry》中指出,这些信号应该是〖非特异性结合细胞的荧光染料的高阶络合物〗,因为这些信号呈随机、点状染色,亮度强于特异性染色的大群细胞。这些信号可影响一些微量亚群识别的准确性。(见下图)
r3.jpg


不过,这个名词“高阶络合物”(High-order complexes)以前确实没听说过,个人觉得应该类似于细胞粘连,染料之间也可能发生有序的粘连,然后非特异性粘到细胞上。精通此概念的FLOWER欢迎留言。

在解决方法上,Pratip K提出了如下解决办法:
1、染色时
将要染色的抗体组合搭配成cocktail(就是混合在一起)后,记得在微量离心机中全速旋转几分钟,然后再将这个上层的cocktail转移到新管子,能够有效避免染料的高阶络合物干扰染色。
这个方法是一种细节处理方法,确实容易忽略,平时大家如果碰到染料高阶络合物信号多的时候,可以试一试。

2、分析时
分析时画一个如下图这样的门,排除掉这些高阶络合物,然后再对这群细胞进行参数转换(Logicle或者Log转换)。分析时的这种设门方法在OMIP系列中经常可看到:http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ion=view&ctid=6

r4.jpg

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发表于 2016-11-15 21:27:26 来自手机 | 显示全部楼层
奇怪,难道是电压、补偿未合理调节?
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发表于 2016-11-16 15:52:50 | 显示全部楼层
我遇到过同样的情况,是补偿的问题。
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 楼主| 发表于 2016-11-16 20:03:23 | 显示全部楼层
昨天的结果已公布,现在出了一个新的问题,大家继续猜

@xye_an  @一成天   @hbezyr
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发表于 2016-11-16 20:16:07 来自手机 | 显示全部楼层
少量细胞贴于基线处,流体周围涡流干扰引起的杂信号?
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发表于 2016-11-16 23:55:13 | 显示全部楼层
偏差这么大,要么是气泡/不稳定的液流引起的,要么是细胞碎片或非单细胞颗粒。
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 楼主| 发表于 2016-11-17 20:18:58 | 显示全部楼层
昨天新发案件的结果已公布:)
@xye_an  @一成天  @hbezyr
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发表于 2016-11-18 17:27:02 | 显示全部楼层
这个活动挺好的,支持!
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发表于 2016-12-2 23:46:00 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-11-17 20:18
昨天新发案件的结果已公布:)
@xye_an  @一成天  @hbezyr

老师,请问是不是一个标本里面加入多种抗体,最好是把抗体先混合后,在一步加入标本?
需要有什么注意的操作吗?
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