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流式细胞术检测海因小体

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发表于 2017-1-9 20:26:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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什么是海因小体

在了解这项新的流式应用之前,我们先了解一下海因小体的概念:

海因小体是红细胞内变性珠蛋白的包涵体。光镜下可见红细胞内1-2μm大小颗粒状折光小体,分布于胞膜上。
海因小体的形成是由于氧化等因素对血红蛋白造成的损害而变性形成的细胞内包涵体,沉积于细胞膜上并对其造成损害,受损红细胞易被脾脏的巨噬细胞吞噬。

这种对血红蛋白分子的损害通常由于氧化应激或遗传性突变造成,例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症。

海因小体的形成是提示体内氧化应激状态的高度灵敏指标。
海因小体也可见于慢性肝病和地中海贫血。
海因小体与药物毒性也存在相关性。
在Wilson病患者外周血中亦可检测到海因小体,提示铜中毒。
海因小体对诊断和管理患者很重要。然而,海因小体的显微镜检查有存在缺点,故需要一种更好的方法。流式来了。

流式检测海因小体

外周血标本
G6PD缺乏患者——已确诊,日常表现正常,年龄25~45岁,未经历过急性溶血危象,过去30天内未出现过发烧、炎症或感染或服用抗炎药物。
正常对照——健康人


体外诱导海因小体的方法
从缺乏G6PD和健康志愿者的患者中收集全血样本后,4度1455g离心5分钟,去掉血浆层和白膜层,收集红细胞。然后红细胞沉淀用RPMI 1640洗涤三次,每次离心条件为931g、4度、5分钟。
最后,红细胞团块用等量PBS重悬,使血细胞压积50%。
乙酰基苯肼溶液由100mg乙酰基苯肼溶解于100ml缓冲液中(缓冲液配方参见:Palasuwan A, Soogarun S, Lertlum T, Pradniwat P, Wiwanitkit V. Inhibition of Heinz body induction in an in vitro model and total antioxidant activity of medicinal Thai plants. Asian Pac J Cancer Prev 2005;6:458–63.)。洗涤过的红细胞与0.1mM乙酰基苯肼溶液在37度孵育1小时,诱导红细胞中的海因小体的形成。


流式检测
使用FACSCanto II流式细胞仪(2激光6色,配备488nm 20mW固态激光器和633nm 17mW固态激光器)检测海因小体阳性的RBCs。



设门方法
fig1.png
图1、FSC/SSC设门方法

fig2.png
图2、FL-1到FL-6的直方图,观察图1门内红细胞海因小体在哪个通道上检测效果最好,从MFI和百分比可见FL-3最好。

fig3.png
图3、海因小体荧光强度随时间的变化,从MFI看,45分钟达到最高。

fig4.png
图4、海因小体的稳定性测试,发现第3天和第0天的MFI无显著差异。


结果
用乙酰苯肼处理的RBC可形成海因小体,可以通过流式的FL3通道检测到荧光,荧光在乙酰苯肼孵育后45分钟时达到最大强度,并且可稳定至少72小时。流式细胞仪可以检测到Heinz小体的RBC阳性,即使它们只占总RBC群体的0.1%。

G6PD缺陷患者海因小体阳性的RBCs的百分比和数量分别为68.9±27.5%和96014±35732个细胞/ul。
健康人海因小体阳性的RBCs百分比和数量分别为50.9±28.6%和74688±36514个细胞/μL。

这种方法快速、可靠,临床可以替代镜检。

参考文献:Palasuwan, D., Palasuwan, A., Charoensappakit, A. and Noulsri, E. (2016), A novel flow cytometry-based method of analyzing Heinz bodies. Int. Jnl. Lab. Hem.. doi:10.1111/ijlh.12576
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