找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

查看: 3227|回复: 6

[细胞因子检测] Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug,有用这个刺激剂的吗

[复制链接]
发表于 2017-3-1 23:33:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星已解决
请教各位老师,就是测胞内因子总是测不出来,不知道是刺激不够还是破膜出了问题这里安全说明书的操作.不知道有没有错:

1. 1:1全血与1640混匀(0.5ml与0.5ml)

2.加入BD Pharmingen™ Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™ 2ul(但是放-80度,每次都要反复冻融,但是说明书又这么说的。。不知道各位有没有高见啊)

3.孵箱中6个小时


以下操作未在无菌台中进行


4.取200ul全血与1640混匀血与流式细胞管中

5.裂解红细胞,洗1次(洗了后我倒了过后在瓶口用棉签把水吸干了,流回去的估计10-20ul最后)

6.加入stain buffer 50ul,加入CD3-FITC,CD4-APC(这里因为以前表面染色的时候用的2ul也做了一些结果,这几次也没有用说明书推荐计量的5ul,因为说明书用100ulbuffer+5ul抗体,不知道影响大不),避光孵育15分钟,然后洗一次,倒干净(倒的时候也是吸干净了,每一次倒液体都尽量倒干净了)

7.加固定破膜剂500ul,充分混匀(加进去的时候我来回吹打了,然后vertex了),避光20分钟

8.离心,倒掉

9.加入破膜buffer 2ml,避光10分钟,然后离心,倒掉

10.加入IL-17A-percy5和IFN-γ-pecy7 各2ul(说明书说的5ul),避光孵育30分钟

11.buffer洗一次,上机。

不知道各位看看标本处理有没有问题啊~万谢

最佳答案

查看完整内容

说明书是说要长期保存的话,需保存在-80度,短期就4度保存即可,反复冻融没必要。 至于刺激效果,很难判断,我的建议是你再提取单个核细胞培养刺激试试,如果还是标不出来,需要依次排除破膜剂、抗体等原因。步骤问题不大。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2017-3-1 23:33:24 | 显示全部楼层
说明书是说要长期保存的话,需保存在-80度,短期就4度保存即可,反复冻融没必要。
至于刺激效果,很难判断,我的建议是你再提取单个核细胞培养刺激试试,如果还是标不出来,需要依次排除破膜剂、抗体等原因。步骤问题不大。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2017-3-2 10:16:08 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-2 10:01
说明书是说要长期保存的话,需保存在-80度,短期就4度保存即可,反复冻融没必要。
至于刺激效果,很难判断 ...

谢谢老师啊,主要不清楚短期一般又能保存多久,根据您的经验来看呢
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2017-3-2 10:17:38 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-1 23:33
说明书是说要长期保存的话,需保存在-80度,短期就4度保存即可,反复冻融没必要。
至于刺激效果,很难判断 ...

还有就是我听闻可以稀释后冻存,不知道有这么干的吗
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-3-2 10:49:38 | 显示全部楼层
lewiski 发表于 2017-3-2 10:17
还有就是我听闻可以稀释后冻存,不知道有这么干的吗

不放心可以先分装成小包装,再冻存。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2018-12-10 10:12:25 | 显示全部楼层
想知道后面刺激出来了吗
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2018-12-13 18:56:53 来自手机 | 显示全部楼层
可以分成小包装在冻存,这产品还是避免反复冻融的好,用多少取多少。按照倪老师的方法好点,你可以提PBMC再做,不过我想倪老师是否有必要再开一次这个实验的专题,我看好像挺多人问这个问题的,特别是具体操作步骤,虽说站内有挺多关于这方面的帖子,但,问的战友好像依然挺多的
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2|浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2024-3-29 19:46

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表