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[结构和原理] 请教各位老师关于染5色分组的问题

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发表于 2017-3-9 10:17:56 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏10流星已解决
本人由于刚刚接触流式技术,所以想请教大家一个分组问题。现在想做染5色的,如APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10。按照我自己的理解我觉得可以这样分组:
APC-eFluor® 780单标:调补偿
                 PE-cy7单标:调补偿
                      APC单标:调补偿
        PerCP-Cy5.5单标:调补偿
                    FITC单标:调补偿
APC-eFluor® 780   FMO对照:只加4种抗体,即PE-cy7-B220;APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10;
                 PE-cy7  FMO对照:只加4种抗体,即APC-eFluor® 780-CD19APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10;
                     APC  FMO对照:只加4种抗体,即APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10;
        PerCP-Cy5.5  FMO对照:只加4种抗体,即APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD1d;FITC-IL-10;
                    FITC  FMO对照:只加4种抗体,即APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;

               样本管检测:加全部抗体,即APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10;

综上所述,大概需要做11管的量,由于第一次做流式,所以发帖来问下各位老师这个分组合不合理,或者有没有更好的建议呢?谢谢各位老师!

最佳答案

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可以根据你要分析的指标进行微调。CD1d、IL-10我觉得应该很难染,可借用CD3 APC 和CD3 FITC代替调节。 至于FMO对照,要根据你分析的指标来定,例如你指分析不同B细胞亚群中的IL-10和CD1d,那么只需要设置这两个通道的FMO即可。
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发表于 2017-3-9 10:17:57 | 显示全部楼层
可以根据你要分析的指标进行微调。CD1d、IL-10我觉得应该很难染,可借用CD3 APC 和CD3 FITC代替调节。
至于FMO对照,要根据你分析的指标来定,例如你指分析不同B细胞亚群中的IL-10和CD1d,那么只需要设置这两个通道的FMO即可。
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 楼主| 发表于 2017-3-10 09:33:48 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-9 18:28
可以根据你要分析的指标进行微调。CD1d、IL-10我觉得应该很难染,可借用CD3 APC 和CD3 FITC代替调节。
至于 ...

倪老师您好,由于刚学所以不明白您说的“借用CD3 APC和CD3 FITC代替调节”这句话,能请您说具体点么?我是只分析IL-10和CD1d,那是否需要给IL-10和CD1d再分别设置同型对照呢?其他指标如CD19,B220,CD5这三个,因为是新手,所以还不知道这几个指标好不好设门,那么这三个指标不设置FMO是否也需要给他设置同型对照呢?
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发表于 2017-3-10 20:08:32 | 显示全部楼层
Noddy 发表于 2017-3-10 09:33
倪老师您好,由于刚学所以不明白您说的“借用CD3 APC和CD3 FITC代替调节”这句话,能请您说具体点么?我 ...

其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好,容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节补偿一言两语说不清,意思就是IL-10和CD1d这两个抗原表达量低,而且前者还需要破膜,所以他们对应的通道用这两个抗体不太合适,需要用强一些的抗原来代替补偿调节。
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 楼主| 发表于 2017-3-15 10:16:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-10 20:08
其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好,容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节 ...

倪老师您好,我同一个样本要检测两种细胞,一种细胞标记是:APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD1d;PerCP-Cy5.5-CD5;FITC-IL-10;另外一种细胞标记是APC-CD4;FITC-CD25;PE-Foxp3。按照您上面回复的意思,每一种颜色的补偿只需要加入一种抗体就够了(比如APC这个标记,我只需设置APC-CD4单标组,可以不设置APC-CD1d单标组补偿)?
所以我设置的单标补偿组就可以是APC-eFluor® 780-CD19单标;  PE-cy7-B220单标;APC-CD4单标;PerCP-Cy5.5-CD5单标;FITC-CD25单标;PE-Foxp3单标。总共6种单标补偿。
                                 
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发表于 2017-3-16 08:03:28 | 显示全部楼层
Noddy 发表于 2017-3-15 10:16
倪老师您好,我同一个样本要检测两种细胞,一种细胞标记是:APC-eFluor® 780-CD19;PE-cy7-B220;APC-CD ...

补偿是用单标,调节渗漏到附近通道的数值,但一定要采取高表达的抗原,你选择的这几个单标抗体中,CD25和FoxP3不行,前者表达阳性比例不高,而且强度也不高,后者需要破膜,也不适合调节补偿,可采用CD3 FITC和CD3 PE代替调节。
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 楼主| 发表于 2017-3-17 09:21:58 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-16 08:03
补偿是用单标,调节渗漏到附近通道的数值,但一定要采取高表达的抗原,你选择的这几个单标抗体中,CD25和 ...

那这个CD25表达阳性比例不高,而且强度也不高,需不需要给设同型对照呢?因为这个细胞只染3色,感觉没必要设FMO了,但是不知道有没有必要设同型对照。
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发表于 2017-3-17 20:16:58 | 显示全部楼层
Noddy 发表于 2017-3-17 09:21
那这个CD25表达阳性比例不高,而且强度也不高,需不需要给设同型对照呢?因为这个细胞只染3色,感觉没必 ...

你要分析的是Treg吧,那样的话不需要。
如果是要单纯分析CD25的表达率,那么建议用FMO对照或生物学阴性对照最佳。
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 楼主| 发表于 2017-3-18 13:26:03 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-17 20:16
你要分析的是Treg吧,那样的话不需要。
如果是要单纯分析CD25的表达率,那么建议用FMO对照或生物学阴性对 ...

是的,两种细胞都是分析细胞,并不是分析表达率。
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 楼主| 发表于 2017-5-22 10:18:41 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-3-10 20:08
其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好,容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节 ...

倪老师您好,我这个检测有4个实验分组,每组5个样本。然后我想问您这种FMO对照是每个样本都设置?还是说样本的个体差异影响不大,一个实验分组设置一个就行了呢?
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