流式可以像GPS那样定位检测细胞内蛋白质

niwanmao

细胞信号传导涉及分子间事件的复杂级联，其最终导致一种或多种功能性细胞反应。 大多数外源性刺激诱导转录因子或转录调节蛋白的活化和核移位， 一旦移位到细胞核中，转录因子就能修饰转录活性以改变细胞蛋白质组表达，并使细胞适应其环境。

蛋白质的亚细胞定位在调节其活性或功能方面具有重要作用。 大多数蛋白质可以在多个细胞室中起作用，它们的定位决定了它们的功能。 例如，在正常条件下，蛋白二硫键异构酶（PDI）ERp57在调节内质网（ER）腔内的蛋白质折叠中起作用。 然而，在应激条件下，ERp57可能转位入核并作为转录因子。 对于典型的转录因子，细胞质内的定位对其功能具有抑制作用，而转移到细胞核使其能够修饰转录活性。 此外，细胞发生病变时，通常的特征在于一个或多个亚细胞区室中的特定蛋白质的不平衡，其可用于诊断或预后，例如p53和NF-kappa B。

现在有很多分析亚细胞定位的技术，包括共聚焦显微镜和选择性提取蛋白后进行Western Blot检测。然而，大多数这些技术依赖于均质细胞制备。在高度复杂的细胞混合物中，例如全血，分析细胞活化和亚细胞定位变得困难得多。感兴趣的细胞通常需要在分析之前从血液中分选，或者需要通过流式细胞术分析样品。即使研究人员可以使用必要的昂贵设备，细胞分选也是很花时间的，而且对样本要求很高，回收的细胞要进行下一步检测可能还需要隔一个晚上。即使上述步骤都能顺利完成，条件都能保持最佳，但由于细胞不再处于原本的内在生理环境中，从这些样品获得的结果可能会发生一些改变，使实验结论发生偏差。通常，最好使用流式细胞术在其内源环境中直接分析复杂样品，但是基于流式细胞术的分子生物测定方法极其有限。

现代流式细胞仪可以进行多达10个甚至更多的多参数分析。然而，在这些众多参数中，并不会提供关于蛋白质定位的任何信息。这使得蛋白质活化的分析只能局限在蛋白质修饰（通常是磷酸化）上，随着用于其核定位的替代物的特定转录因子的改变的增加。

成像流式细胞术为确定亚细胞定位提供了解决方法。在成像流式细胞术中，悬浮液中的细胞通过流式细胞术和通过时间延迟整合操作的CCD照相机进行多参数分析。然而，图像是2D而不是3D，并且核定位的评估仍然是大多数定性的，因为核膜内的信号的计算不能完全反映细胞的3D深度。类似地，能够评估形态特征和亚细胞定位的另一种技术是激光扫描细胞计数（LSC）。 LSC提供比成像流式细胞仪更高分辨率的图像，并且由于样品不被丢弃到废物流中，因此允许研究人员对细胞进行时间分辨研究，包括酶和药物动力学研究、细胞形态变化分析或DNA凝聚，甚至使用不同探针对单个细胞进行序贯分析。

为了简化复杂细胞混合物中亚细胞定位的问题，Beckman Coulter的George C. Brittain等人在2017年3月30日的Cytometry A安发表了《A Rapid Method for Quantifying Cytoplasmic Versus Nuclear Localization in Endogenous Peripheral Blood Leukocytes by Conventional Flow Cytometry》，介绍了他们研发的专有试剂盒，利用两种不同的破膜剂（分别破胞膜和破核膜），结合表面标记，检测不同种类细胞内，相关胞内分子的细胞质、细胞核定位。

首先看方法流程示意图，步骤和普通的破膜染色操作类似，关键在于他们的破膜剂（图中的Lysis Buffer）有两种，Buffer1只破胞膜，而Buffer2可以同时破胞膜和核膜：


实验结果看上去不错，首先用DAPI/SSC去掉碎片，然后根据CD14/SSC选出单核细胞、粒细胞和淋巴细胞，再接着在淋巴细胞中选出CD3＋T细胞。


下面看三类细胞的蛋白质定位检测结果：
灰色是同型对照，作为阴性参照曲线；
蓝色曲线是用Buffer 1（即只破胞膜，不破核膜）处理过的，可以看到位于胞内的alpha-tubulin、GRP78、Smac均可检测出，但检测不到只位于核内的Lamin B。
红色曲线是用Buffer 2（同时破胞膜和核膜）处理后的，除了可看到胞内蛋白均能检测到，核内的Lamin B也能被检测到。



后面作者还进行了一系列验证，结果看着挺好，具体可点击“阅读原文”在线查看PDF。
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTIyNDd8ZTM1NzhkZjl8MTcxMzYwMTY4MXwwfA%3D%3D