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[其它] 请教一下各位高手我这种结果是怎么造成的

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发表于 2017-5-30 20:24:54 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
我今天做了一次流式,想要检测一下细胞周期相关的一些因子的表达情况,但是我的Isotype出来的图像很怪异,之前没有遇到过这种情况,想请大家帮忙看看可能是什么原因。
我的大概流程是这样的:
1. 收集细胞,离心,70%乙醇4℃固定1h;
2.PBS+2%BSA洗涤两次;
3.PBS+2%BSA室温孵育30min封闭表面特异性结合位点;
4.一抗室温孵育30min,洗涤一次;
5.二抗室温孵育30min,洗涤两次;
6.过滤,上机。

我用的二抗是Cy5染料,实验组的图都不这样的,只有isotype非常怪异……







isotype

isotype

isotype

isotype

实验组

实验组

实验组

实验组
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2017-5-31 08:08:52 | 显示全部楼层
为何用70%乙醇固定?
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 楼主| 发表于 2017-5-31 08:40:54 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-5-31 08:08
为何用70%乙醇固定?

写错了,是75%的乙醇,我觉得用乙醇的话固定和通透的目的都能够达到。
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发表于 2017-5-31 08:56:16 | 显示全部楼层
Pukureus 发表于 2017-5-31 08:40
写错了,是75%的乙醇,我觉得用乙醇的话固定和通透的目的都能够达到。

真不建议,乙醇对细胞形态和非特异性荧光影响很大,染DNA还好,染表面和胞内标记,结果就很容易出问题。
我不知道你做的是什么标记,目前的建议是:
1、用商品化固定破膜Kit。
2、使用生物学阴性对照。
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 楼主| 发表于 2017-5-31 09:17:03 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-5-31 08:56
真不建议,乙醇对细胞形态和非特异性荧光影响很大,染DNA还好,染表面和胞内标记,结果就很容易出问题。
...

谢谢老师的建议,老师有没有什么用得比较好的商品化固定破膜kit呢,因为我们实验室之前都没有人做流式,我是第一个做的,一直都是拿乙醇来固定破膜的,之前听说有人是用4%多聚甲醛固定然后用皂素破膜的。

还有老师您说的生物学阴性对照指的是不加抗体的空白对照吗?
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发表于 2017-5-31 11:11:08 | 显示全部楼层
Triton X-100 (曲拉通 X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚。这个我们经常用。还有常用的一种破膜剂是CHAPS,没用过。

另外商业化的破膜剂ebio用过不错,其他的不知道
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 楼主| 发表于 2017-5-31 11:42:06 | 显示全部楼层
chymanhz 发表于 2017-5-31 11:11
Triton X-100 (曲拉通 X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚。这个我们经常用。还有常用的一种破膜剂是CHAP ...

非常感谢!我先试一下Triton X-100,要是做不好就买试剂盒了。
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发表于 2017-5-31 14:57:07 | 显示全部楼层
我觉得破膜还是个很关键的因素的,之前做T细胞的细胞因子染色时我发现,用破细胞膜的kit根本染不出来,但是用破核膜的kit(比如foxp3的kit)就染出来了。破膜剂的浓度和成分是个学问,像triton、saponin和chaps都是非极性表面活性剂(去垢剂),要是多了细胞直接就碎了,少了抗体又进不去,不知道有没有人研究过这个问题,借楼主这个话题跟各位老师讨论一下胞内、核内染色的问题。
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发表于 2017-5-31 21:47:57 | 显示全部楼层
小憨 发表于 2017-5-31 14:57
我觉得破膜还是个很关键的因素的,之前做T细胞的细胞因子染色时我发现,用破细胞膜的kit根本染不出来,但是 ...

确实,浓度非常关键。
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