紧急求助~ JC-1检测血小板膜电位相关问题

zx232

本人最近实验采用碧云天公司的JC-1检测试剂盒，检测血液样本中的血小板膜电位。实验过程中遇到不知道如何处理的问题，求助！望各位老师不惜赐教！
1. 我是从全血中提取血小板后进行JC-1染色，然后上流式的。按照说明书上悬浮细胞10万-60万，进行染色处理，然而多次实验发现，不同的细胞量与0.5ml的JC-1进行染色后，膜电位有很大差异，也就是说细胞数量与JC-1的比例很重要？之前也看过文献，似乎是有这方面的报道，但是原理没大清楚。

图1： 60万血小板+ 0.5ml JC-1染料

60万

图:30万血小板+ 0.5ml JC-1染料

30万

图3  CCCP控制组

CCCP处理

从实验结果看，30万细胞染色的电位会高于60万细胞？？

问题2 ：  请问大家如果调节补偿？
我采用上面三张图同样的电压条件，在另外一天进行实验，CCCP组，有一部分细胞会在右上角的区域（如下图），请问CCCP处理后是应该全部位于右下角吗？还是大部分丢失电位，可有小部分位于右上角，能否通过调节电压把他压下去？？（关键上面三张图是同样的电压条件，能否随便改变，还是一旦确定后电压不能变动

图4  CCCP异常组  是否与补偿调节有关，目前实验没有进行调节补偿，是否需要？
）

CCCP处理 似乎不对

图 5   该条件下 检测样本图
样本1

样本1

样本2

样本2

请问老师们, 这样的结果能分析吗？ 需要怎么调节！ 本人万分感激，实验做的不好，心情焦躁无比！

niwanmao

从你的图上看，噪音信号怎么这么多？几十万的血小板才取到这点似乎不应该吧，有没有可能圈错了，所以导致JC-1的信号不正确。

CCCP那组感觉是比较正常的，血小板是应该这样分布，JC-1的补偿调节得过了。

zx232

niwanmao 发表于 2017-6-8 18:17
从你的图上看，噪音信号怎么这么多？几十万的血小板才取到这点似乎不应该吧，有没有可能圈错了，所以导致JC ...

倪老师，右边的散点是只显示了一部分比例的，我没有显示100%. 因为不会调补偿，这些图是完全没有调任何补偿的结果。想问下CCCP处理的样本要通过调节电压百分百压在右小区域吗？

zx232

第一张图，左下是噪音，可能因为血小板体积比较小，我用纯净水上样，第一张图左下角那部分会出现，所以给去掉了，第一张右上角那部分去掉是因为体积偏大，镜下也看到有红细胞，我认为大的是红细胞，所以去掉了，不知道这样分析对吗？

niwanmao

zx232 发表于 2017-6-8 18:35
第一张图，左下是噪音，可能因为血小板体积比较小，我用纯净水上样，第一张图左下角那部分会出现，所以给去 ...

应该将FL2电压调高一些就差不多了。其它貌似还可以。

zx232

niwanmao 发表于 2017-6-8 20:10
应该将FL2电压调高一些就差不多了。其它貌似还可以。

倪老师，再弱弱的问下，我看文献都是用FL2/FL1表示，是不是我就用Y Mean／Y Mean直接算呢