肿瘤细胞染CFSE

喃呢

打算做细胞杀伤实验，现在在做预实验，分别用CFSE和PI染肿瘤细胞，现在的问题是用CFSE单染后，图的位置不对，不知道是荧光太强了还是什么原因。因为用BD C6做的，只能调补偿，得出的图也感觉有问题，请各位帮忙看看，谢谢！
第一个图是没有调补偿的，第二个图是调过补偿的

没有调补偿之前

调补偿之后

niwanmao

还需要看FSC和SSC散点图，看细胞状态。
CFSE最难的问题在于浓度上，浓度和培养时间的优化，决定着这个实验的成败。

喃呢

niwanmao 发表于 2017-7-18 14:09
还需要看FSC和SSC散点图，看细胞状态。
CFSE最难的问题在于浓度上，浓度和培养时间的优化，决定着这个实验 ...

这是散点图，也考虑过CFSE的浓度问题，现在做了两个浓度，差距不大，都是这样的，所以我在想是不是调补偿或者仪器的问题，CFSE的浓度是10umol/L

niwanmao

喃呢 发表于 2017-7-18 14:37
这是散点图，也考虑过CFSE的浓度问题，现在做了两个浓度，差距不大，都是这样的，所以我在想是不是调补偿 ...

浓度是可以的，这个浓度可以支持2～14天的增殖实验，你可以继续跟踪几天看看子代是否会出现

ghqiu09

我觉得除了CFSE的浓度，标记的时候细胞的浓度也很重要，细胞浓度太低了，细胞容易死，然后细胞的荧光就特别的高

喃呢

niwanmao 发表于 2017-7-18 21:12
浓度是可以的，这个浓度可以支持2～14天的增殖实验，你可以继续跟踪几天看看子代是否会出现 ...

可能是时间太短了浓度太高吧，染了色之后几个小时就开始测了

喃呢

ghqiu09 发表于 2017-7-19 10:54
我觉得除了CFSE的浓度，标记的时候细胞的浓度也很重要，细胞浓度太低了，细胞容易死，然后细胞的荧光就特别 ...

我觉得还是细胞浓度和染料比例不对

喃呢

把浓度又调低了些，终于出来了

小憨

请教一下各位flower们，甲醛固定会对CFSE有影响吗？

niwanmao

小憨 发表于 2017-7-24 17:58
请教一下各位flower们，甲醛固定会对CFSE有影响吗？

可以的。

CFSE (5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester) is a cell permeant, non-fluorescent pro-dye. Intracellular esterases in live cells cleave the acetate groups which results in the green fluorescent molecule carboxyfluorescein that is now membrane impermeant. The succinimidyl ester group reacts indiscriminately with intracellular free amines to generate covalent dye-protein conjugates. The result is live cells with an intracellular fluorescent label. At appropriate concentrations CFSE is non-toxic to cells and the fluorescence is retained after formaldehyde and alcohol fixation. CFSE labeled cells can be detected with any instrument or filter set compatible with fluroescein detection: Excitation(max)=492nm, Emission(max)=517nm.