细胞数量增加10倍，抗体用量应该增加多少？

niwanmao

在回答这个问题之前，其实首先要确定实验中抗体的最佳浓度，这个过程就是『滴定』。

滴定非常重要的。因为抗体太多或太少，都将导致非特异性染色增加、信噪比降低、灵敏度降低、表达水平与染色强度之间缺乏线性，并会增加的实验成本。

靶标不同、染色条件（即染色时间和温度）不同、抗体批号不同，为稳妥起见，均需进行滴定。活细胞和固定细胞可能不同，表面标记和胞内、核内标记也会不同，商品化试剂尽管有推荐用量，但由于他们测试的条件不同，因此必要的时候还是最好滴定。

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参考文献：
Eur. J. Immunol. 2017. 47: 1584–1797 Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies

chen1084497228

请问倪老师，我们使用的抗体说明书提示一般是每人次加入多少微升，我该怎么才能换算成老师您说的ug/ml呢？

niwanmao

chen1084497228 发表于 2017-11-15 15:01
请问倪老师，我们使用的抗体说明书提示一般是每人次加入多少微升，我该怎么才能换算成老师您说的ug/ml呢？ ...

抗体瓶身上一般有浓度说明的，你按照那个浓度*你加入的体积，然后再除以样本总体积，就可以算出滴定时的终浓度了。

lidan_zhao

请问倪老师，流式抗体在滴定的时候是依据总细胞数还是活细胞数，有时候组织中分离的细胞活率不是太高。另外不同部位分离的淋巴细胞（percoll分离后）性状也会相差很大吗，在FSC和SSC上相同电压位置为何也不一样。

niwanmao

lidan_zhao 发表于 2018-5-24 02:44
请问倪老师，流式抗体在滴定的时候是依据总细胞数还是活细胞数，有时候组织中分离的细胞活率不是太高。另外 ...

主要是体积。总细胞数控制在1×10E6以内

Kelly_Ge

老师，染色直方图怎么画啊

紫景风麟315

Kelly_Ge 发表于 2019-3-11 14:10
老师，染色直方图怎么画啊

flowjo里可以吧

啵啵嘟

倪老师，我想请问如果我用的是Biolegend和BD的抗体，官网推荐用量是<0.25ug/100ul*10^6 cells，我用的是0.07ug/100ul，细胞量大概在10^6（算上碎片的话4*10^6），我想请问下这样的用量合理吗，官网只给了最大浓度。

啵啵嘟

倪老师我还有个问题就是我分选的时候用了两个不同浓度染色在两台分选仪器（一台BD一台贝克曼）上做（分别是0.1ug/100uL，0.06ug/100uL)，结果染出的荧光强度和细胞群比例相差很多（我的目标群是APC-Cy7阴性的细胞，还染了7AAD），我想请问下老师抗体浓度的差异以及细胞浓度的差异对实验结果有这么大的影响吗，还是可能是其他原因。谢谢老师。

niwanmao

啵啵嘟 发表于 2019-9-4 19:37
倪老师我还有个问题就是我分选的时候用了两个不同浓度染色在两台分选仪器（一台BD一台贝克曼）上做（分别是 ...

Beckman那台的FSC电压你好像没调出来啊