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[结构和原理] 固定对细胞膜表面蛋白影响

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发表于 2017-11-25 17:10:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
倪老师,你好,我想检测不同时相的膜蛋白表达量,用PI染核的话需要破膜,破膜是否会导致膜蛋白离开原本的细胞,这样测出来的某一时相的膜蛋白就不再准确,如果不破膜,在染核前固定细胞增加通透性是否能让PI染核,我咨询过碧云天的顾问,说”细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒“里不含有破膜成份,细胞固定后成为死细胞就能被PI染色;我也考虑过用DAPI染核,可去测流式的时候操作老师说DAPI不行,它的发光原理与PI不同,他也不愿意多说,请教倪老师DAPI是否能用,我的问题该如何解决,谢谢老师

发表于 2017-11-26 17:43:53 | 显示全部楼层
你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响,可以先对比测试一下看看就知道了,一般应该没你想象的这么严重。

至于DAPI是不需要破膜的,但是需要紫外光激发,如果你们的流式细胞仪没有紫光激光,就不能用。

至于细胞凋亡试剂盒,那是PI是低浓度的,死细胞膜破了,所以能染,活细胞染不进去的。
 楼主| 发表于 2017-11-27 15:59:38 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-26 17:43
你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响,可以先对比测试一下看看就知道了,一般应该没你想象的这么严重。 ...

首先我必须明确一点您的意思是DAPI的确是可以用作流式中测细胞不同时相比例,我们的是405nm激发光,DAPI的是355,有些偏差,但也可以用;
那我打算这样做一下预实验:
        一组, 膜蛋白标记荧光抗体后用DAPI染核测不同时相膜蛋白表达比例,
        二组,膜蛋白标记荧光抗体后用多聚甲醛固定细胞再用DAPI染核测不同时相膜蛋白比例
以此来分析固定细胞是否影响不同时相膜蛋白测定
 楼主| 发表于 2017-11-27 16:05:25 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-26 17:43
你要检测的膜蛋白是否会受固定、破膜影响,可以先对比测试一下看看就知道了,一般应该没你想象的这么严重。 ...

固定细胞使细胞膜通透性增加,机制是怎样的,是破坏了膜结构还是仅仅增加了渗透性
PI染核仅仅使用多聚甲醛固定细胞,不用破膜剂处理可以进行染核吗
发表于 2017-11-28 08:06:15 | 显示全部楼层
guanyu 发表于 2017-11-27 16:05
固定细胞使细胞膜通透性增加,机制是怎样的,是破坏了膜结构还是仅仅增加了渗透性
PI染核仅仅使用多聚甲 ...

固定细胞不能使膜通透性增加,这个机制你要理解一下。
只有破膜才能。破膜的机制大多是去污剂,就是将膜表面的大多数胆固醇分子溶解掉,只留下骨架蛋白,从而形成孔洞,方便抗体进入。
 楼主| 发表于 2017-11-28 08:39:01 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-28 08:06
固定细胞不能使膜通透性增加,这个机制你要理解一下。
只有破膜才能。破膜的机制大多是去污剂,就是将膜 ...

首先万分感谢老师回复
去污剂,例如Triton,我所查到的是它们为两亲性分子,与两亲性分子磷脂,蛋白质的亲水端,疏水端结合而产生作用:而皂素较为温和,与胆固醇结合后将胆固醇移除,形成孔洞。
倪老师,您所说的去污剂将膜表面胆固醇溶解掉,留下骨架蛋白是所有的破膜剂机制,还是皂素的,我想测膜表面蛋白的话不能使其破坏,是不是只能使用皂素了?
固定细胞后染核更容易是因为膜被破坏了吗?
谢谢老师解疑
发表于 2017-11-28 09:18:04 | 显示全部楼层
guanyu 发表于 2017-11-28 08:39
首先万分感谢老师回复
去污剂,例如Triton,我所查到的是它们为两亲性分子,与两亲性分子磷脂,蛋白质 ...

因为首先染胞膜分子,而且经过了固定,所以无论用何种,都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一关,那么就用皂素,但是需要有心理准备,皂素破膜能力有限,只能破到细胞膜,破不了核膜。
固定是为了防止蛋白质丢失,把框框固定住了,就丢不掉了。
 楼主| 发表于 2017-11-28 10:05:58 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-28 09:18
因为首先染胞膜分子,而且经过了固定,所以无论用何种,都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一 ...

就是经过固定细胞后,Triton即使与膜上磷脂,蛋白结合形成孔洞,也不会使形成的复合物移除,因为已经经过固定
不知我的理解是否正确
 楼主| 发表于 2017-11-28 10:17:13 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-28 09:18
因为首先染胞膜分子,而且经过了固定,所以无论用何种,都是不需要担心的。

如果真过不了自己的心理这一 ...

首先要赞扬一下这个网站,我觉得从流式中文网学到了很多知识,解了我很多的疑惑
倪老师帮忙看一下实验步骤可行性
我的实验目的是测定不同时相膜蛋白表达:
首先用连接荧光素的抗体与表面蛋白反应,然后洗去多余抗体,接着用多聚甲醛固定细胞(固定细胞一是为了使细胞停止在其所处的时相,二是为了使膜蛋白处在原本的位置,防止跑到其他时相细胞膜上)后,再破膜用PI染核,上流式分析
发表于 2017-11-28 11:05:47 | 显示全部楼层
guanyu 发表于 2017-11-28 10:17
首先要赞扬一下这个网站,我觉得从流式中文网学到了很多知识,解了我很多的疑惑
倪老师帮忙看一下 ...

可以。
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