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流式上常见的五个错误概念

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发表于 2017-11-29 18:54:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

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在流式上,可能师兄师姐传帮带,有时候无意中就传下了一些错误概念,我们来捋一捋比较常见的五个吧。

1、FSC=细胞大小
细胞散射光的强度,涉及光的折射、反射和衍射等原理,并不简单,所以归根到底,FSC只能算是一个光学测量值。
1.jpg
在某个范围内,某些细胞类型可能FSC和细胞大小会呈一定的比例,可以辅助判断,但实际上对FSC影响最大的是细胞内外折射率之间的差异。此外,细胞核比例、细胞颗粒的数量和类型以及细胞的表面形状是否平整等因素也影响细胞散射光。 因此,不要总是认为FSC大就肯定等于细胞大。


2、细胞是用1%多聚甲醛固定的

错了。 多聚甲醛(PFA)是不溶于水的白色粉末,那么你知道你用的究竟是什么溶液呢? 你是否记得配制溶液的时候,多聚甲醛倒入PBS或蒸馏水中是白色的,通过加热或碱化之后就变成了澄清的溶液,那时,它实际上就是甲醛溶液了。
2.jpg
在1997年的Purdue大学的讨论里面就提到了这个事情(http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto3/1/topics/prep/0011.htm)。 不幸的是,这些信息往往被忽视并且误传。



3、细胞是用FACS检测的
尽管解释过很多次,但这个名词还一直在用。 FACS是Fluorescence Activated Cell Sorter的首字母缩略词,是分选仪,这是错误1。第2个错误在于FACS是Becton Dickinson的商品名,因此所有FACS都是流式细胞仪,但不是所有的流式细胞仪都是FACS。
3.png
所以,正确的表达应该是,我流式细胞仪上做实验。



4、我使用的荧光素是发红光的
可能荧光素标记的细胞在显微镜下看起来是红色的,但是做流式的时候,我们知道“红光”指代表640nm到800nm的光谱上的任何位置。 APC、PE-Cy7、RFP等全部是“红色”,但是它们具有完全不同的激发和发射光谱。
4.png
所以,正确的说法应该是指出荧光素的具体名称,然后查出其激发和发射光谱,方可设置合适的激发光和检测滤光片。


5、我用FL1通道检测荧光
如果回到过去,流式细胞仪只能测1~2种颜色,那么我可以很确定FL1是FITC检测通道。但是,现在有些流式细胞仪上,FL1不一定是分配给FITC的,可能是分给了紫光或紫外波长的荧光素。
5.png
所以,正确的做法应该是参考MIFlowCyt指南(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4203-1-1.html),使用分析指标、荧光染料和光学滤光片来标记散点图的坐标。


部分内容引用自:
Derek Davies. Five Things That Irritate Flow Cytometrists



发表于 2017-12-4 16:38:59 | 显示全部楼层
补充几句:
1. FSC大致与细胞直径的平方成正比。但在没有标准微球的情况下,不能得到绝对大小。
3. FACS既可以指流式分选,也可以指流式分析(Sort也有分类的意思),还是BD主力流式细胞仪系列的名称。
5. BD自Calibur和C6以后就不再用FL表示Channel了,倒是BC的流式机器一直保留着这个习惯。
 楼主| 发表于 2017-12-4 21:47:54 | 显示全部楼层
miliamlau 发表于 2017-12-4 16:38
补充几句:
1. FSC大致与细胞直径的平方成正比。但在没有标准微球的情况下,不能得到绝对大小。
3. FACS既 ...

关于第1点,如果加上某个范围或许可以,过大、过小均与大小无关,反而跟光学效应相关,这个是需要明确的。所以即使用标准微球也不行。
发表于 2017-12-4 22:33:56 | 显示全部楼层
本帖最后由 miliamlau 于 2017-12-5 00:02 编辑
niwanmao 发表于 2017-12-4 21:47
关于第1点,如果加上某个范围或许可以,过大、过小均与大小无关,反而跟光学效应相关,这个是需要明确的 ...

谢倪老师指正。根据我们之前检测微藻和血小板的经验,以及文献记载,大约在0.5-10um间,可以近似这么认为。可以用标准微球数据拟合的二次函数回推细胞大小。
 楼主| 发表于 2017-12-5 10:08:59 | 显示全部楼层
miliamlau 发表于 2017-12-4 22:33
谢倪老师指正。根据我们之前检测微藻和血小板的经验,以及文献记载,大约在0.5-10um间,可以近似这么认为 ...

这方面的经验可以分享一下

FSC和SSC与散射光关系,参见:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5063-1-1.html
发表于 2017-12-5 10:34:50 | 显示全部楼层
第1条的那个讲解FSC、SSC的图是很难得一见的讲得那么明白的图,保存了
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