固定破膜后表面FITC消失？

yamapisama2012

FITC-CD19标记骨髓细胞，固定之前上样，显示有29%的阳性峰，等固定打孔处理后基本算没有。为什么？同样固定打孔处理的APC和PE光的流式抗体都有标上。打孔之前Medium和FITC-CD19单染：

固定打孔处理后：打孔的Medium和FITC-CD19单染：

固定打孔流程：
1、FITC-CD19抗体4℃避光，30min
2、PBS清洗1次
3、4%多聚甲醛40微升4℃避光20min
4、PBS清洗1次
5、0.1%皂素避光室温10min
5、PBS清洗1次，过滤上机

细胞状态和固定打孔的过程我认为是没有问题的，但是做了两次都是这样的结果，很是疑惑。。。

niwanmao

4%多聚甲醛40ul，浓度太高，容易影响标记。建议你改用1%或2%。你可以进行到第4步的时候测一下就知道了。

yamapisama2012

好的，谢谢老师，试一下再贴一下结果~

chevalierx

有几个问题LZ在重复试验的时候可以关心下：1）CD19分群并不是很明显，LZ参考下抗体说明书，如果抗体说明书上CD19分群明显，可能需要优化下条件；2）CD19的比例有点高，可能存在假阳性，可能和裂解液有关；3）染色时间有点短，一般的protocol会建议30min at least，可以尝试适当延长染色时间；4）细胞破膜会引起部分膜表面marker内陷，不清楚CD19，但的确存在其他CD分子有这种情况，类似于人CD4胞内染色Th细胞时候出现的问题。

yamapisama2012

niwanmao 发表于 2017-12-26 20:59
4%多聚甲醛40ul，浓度太高，容易影响标记。建议你改用1%或2%。你可以进行到第4步的时候测一下就知道了。 ...

低浓度的多聚甲醛跟4%的多聚甲醛一样的效果，后来是用胞内的IL17做的单染管，虽然只有5%多一点，但是够调节补偿了，谢谢老师

yamapisama2012

chevalierx 发表于 2017-12-27 14:17
有几个问题LZ在重复试验的时候可以关心下：1）CD19分群并不是很明显，LZ参考下抗体说明书，如果抗体说明书 ...

cd19的分群是明显的，中性粒细胞底下有一群小的淋巴细胞群的。
我认为抗体的量是饱和的，染色时间延长至40min也一样标不上呢，时间太长又怕荧光猝灭。
我不明白裂解液是什么。
所以这回实验不用cd19做单染管了，改用了胞内的FITC-IL17，这个有很低的阳性峰，够调节补偿就可以，啊啊啊啊，好难啊....
谢谢建议！

niwanmao

yamapisama2012 发表于 2018-1-9 10:07
低浓度的多聚甲醛跟4%的多聚甲醛一样的效果，后来是用胞内的IL17做的单染管，虽然只有5%多一点，但是够调 ...

能分群就好，后续可以试着摸索一下IL-17抗体的用量，如果找到一个最佳的量，或许能够分得更开些

chevalierx

yamapisama2012 发表于 2018-1-9 10:12
cd19的分群是明显的，中性粒细胞底下有一群小的淋巴细胞群的。
我认为抗体的量是饱和的，染色时间延长至4 ...

你可以看下CD19的散点图，如果明显2群细胞团就可以。抗体的量标准做法是要做滴定的，方法在论坛里可以找到，我就不多说了。时间太长荧光淬灭的问题不用担心，通常在4℃下可以保存很长时间。裂解液是因为你骨髓细胞提出来可能会存在红细胞需要裂红。