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[结构和原理] 为什么镜下观察细胞增殖很明显,cfse只有部分出来了增殖...

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发表于 2018-1-3 18:59:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
做了四组实验  第1组仅有小鼠脾脏淋巴细胞 第2、3、4组为小鼠脾脏淋巴细胞与msc不同条件下共培养,ConA做刺激剂,(第一天msc铺板,第二天将刚刚提的原代淋巴细胞cfse染色后与msc共培养,培养2-3天后收淋巴细胞上流式)共培养2天后光镜下观察如下,接着是cfse染色后流式结果,
第1组还可以光镜下和流式都表现为增殖,  而第2 3组光镜下明明显示增殖很明显,流式却是单峰图像,已经重复两次都是这样,真是百思不得其解,求有经验的各位大神指点啊

光镜下增殖情况

光镜下增殖情况

cfse流式检测

cfse流式检测


 楼主| 发表于 2018-1-4 09:06:03 | 显示全部楼层
是不是共培养的msc对淋巴细胞染的cfse有影响?
发表于 2018-1-4 10:09:16 | 显示全部楼层
1、2、3的FSC和SSC散点图能否晒出来看看?
 楼主| 发表于 2018-1-4 12:08:50 | 显示全部楼层
1.jpg 2.jpg 3.jpg 4.jpg
发表于 2018-1-4 18:07:21 | 显示全部楼层

(1)1 和4 的散点图很像,但是光镜下面完全不同,这有点奇怪。还有光镜下的黑色一团都是什么?为什么4没有?
(2)至于为什么共培养之后出不来,应该是和共培养不同的,你描述一下你使用的CFSE浓度和培养时间看。另外,如果有机会重试,将父代CFSE峰调到10E4试试。
 楼主| 发表于 2018-1-5 13:22:24 | 显示全部楼层
1)1和4散点图很像,光景完全不同,这个我也很不解
2)光镜下黑色的一团应该是淋巴细胞增殖的集落,4组加了抑制增殖的因素,所以没有出现明显增殖的集落
3)培养具体步骤如下:1)取小鼠脾脏,研磨,70um滤网过滤,淋巴细胞分离液离心,取中间层细胞混悬于1640培养基离心得淋巴细胞 2)计数,重悬 密度大概为1-5*10*6/ml ,pbs洗两遍,加cfse,浓度为2uM,常温避光孵育10min,5倍预冷的完全培养基终止染色,冰上孵育5min,pbs洗3遍  3)所得细胞用含10%血清的完全培养基培养2-3天(234组与前一天铺板的msc共培养的,里面加了不同的细胞因子,4是抑制淋巴细胞增殖的)
 楼主| 发表于 2018-1-5 13:24:03 | 显示全部楼层
好的好的,下次调一下电压把父代峰调高一些
也就是 共培养的 msc 会吸收淋巴细胞的染色么?
发表于 2018-1-5 20:59:42 | 显示全部楼层
一僧化画 发表于 2018-1-5 13:24
好的好的,下次调一下电压把父代峰调高一些
也就是 共培养的 msc 会吸收淋巴细胞的染色么? ...

CFSE的染色肯定是没有选择性的,也会染MSC,但是只要终浓度一致,应该不至于出现这么大差异。
我在想,你这里的CFSE终浓度可以想办法变变看,培养2~3天的话,可以再低一点。
发表于 2018-1-6 07:52:11 | 显示全部楼层
我不知道你的MSC是什么细胞,看你样子是个贴壁细胞,做混合淋巴细胞培养分两种一种是双向混合淋巴细胞,一种是单向,如果你是做单向呢,MSC应该用丝裂霉素C处理一下,使MSC细胞不分裂,但这个我觉得不是影响你现在结果的原因,但是按理论MSC是没染CFSE的,如果也被当作淋巴细胞去跑流式,他就被认为是增殖的细胞。

所以我建议你一减低淋巴细胞密度,延长培养时间至5-7days,二是圈门的时候尽可能的增加CD3marker, 确保是观察到的是淋巴细胞群的增殖变化。
 楼主| 发表于 2018-1-8 08:50:06 | 显示全部楼层
whyxa 发表于 2018-1-6 07:52
我不知道你的MSC是什么细胞,看你样子是个贴壁细胞,做混合淋巴细胞培养分两种一种是双向混合淋巴细胞,一 ...

确实是个好建议!下次上机的时候也染一下CD3 marker,在培养时间上也调整一下试试!
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