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[标本处理] 雪貂PBMC分离

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发表于 2018-1-13 12:33:45 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
1. 低温裂解   用4-8˚c的lysis buffer (借鉴Sigma配方1.65g NH4Cl, 0.24g NaHCO3, 40ul 0.5M EDTA, addwater to 200ml)裂解红细胞。在冰浴上裂时,细胞裂解15min后经HBSS洗涤两次后仍有部分明显的红细胞残留。
结果:细胞含量约4x10^5,  活细胞比例80%。(雪貂每次仅能采0.2-0.4ml血)

2常温裂解

用上述lysis buffer ,将buffer恢复到室温,再裂解红细胞。
在室温裂解红细胞时,细胞裂解15min后经HBSS洗涤两次后仍有部红细胞残留。
若室温裂解红细胞时,细胞裂解25min后经HBSS洗涤两次无红细胞残留,但活细胞比例显著下降。降至50%以下。



问题: 1)少量残留红细胞是否影响后续检测(检测目标为一般的细胞分型,CD4,8,B,DC, Granulocyte)。
2)活细胞数太少是否显著影响最终操作步骤完成后的活细胞数。后续操作步骤有: Fc封闭,表面marker染色,固定/渗透后内部marker染色。


发表于 2018-1-13 13:18:34 | 显示全部楼层
1、有红细胞残留,可通过FSC/SSC排除掉。
2、死细胞,可通过在染色完成,上机之前,100ul样本中加入10ul 20ug/ml的PI染液,1分钟上机获取,分析时选PI阴性的活细胞即可。
 楼主| 发表于 2018-1-13 13:43:04 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-1-13 13:18
1、有红细胞残留,可通过FSC/SSC排除掉。
2、死细胞,可通过在染色完成,上机之前,100ul样本中加入10ul 20 ...

多谢多谢!雪貂的全血裂解比较麻烦。
发表于 2018-1-13 18:40:08 | 显示全部楼层
luyexianzong 发表于 2018-1-13 13:43
多谢多谢!雪貂的全血裂解比较麻烦。

你们要检测雪貂的免疫功能?话说雪貂的抗体有卖吗?还是用其它种属的交叉反应?
发表于 2018-1-15 10:18:50 | 显示全部楼层
如果颜色够用的话,加一个CD45,这样即使有少量的红细胞也不影响。通过反圈门的方法在圈淋巴细胞,而且这样分析得到的数据也稳定,不受破红效果影响。
 楼主| 发表于 2018-2-4 13:09:38 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-1-13 18:40
你们要检测雪貂的免疫功能?话说雪貂的抗体有卖吗?还是用其它种属的交叉反应? ...

是的。检测部分免疫功能。
 楼主| 发表于 2018-2-4 13:10:22 | 显示全部楼层
ghqiu09 发表于 2018-1-15 10:18
如果颜色够用的话,加一个CD45,这样即使有少量的红细胞也不影响。通过反圈门的方法在圈淋巴细胞,而且这样 ...

多谢!这个建议好!
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