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[试剂耗材] PI染色法用于流式细胞仪区分死活细胞配方问题

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发表于 2018-1-19 11:58:15 | 显示全部楼层 |阅读模式
19流星
大家好,我是想用流式细胞仪区分海水中活细胞和死细胞相对含量,选择PI染色法染色死细胞,SYBR Green I染色DNA。我准备直接取样1ml海水同时添加PI和SYBR Green I染色在不同波长下统计细胞数,现在想问问大家,PI染色剂的配方,网上的配方多种多样,实在无法辨别真假。恳请做过此类实验的老师同学告知具体配方,PI染剂使用液浓度,终浓度和取样1ml海水后的添加量。

 楼主| 发表于 2018-1-19 12:12:18 | 显示全部楼层
我看到好多网上的配方,包括一些文献中都是配置PI都加了曲拉通Triton X-100,但是也有人说加曲拉通会导致细胞死亡?
发表于 2018-1-20 17:25:27 | 显示全部楼层
因为你是区分死活的,所以不需要加Triton。
PI一般用10ug/ml,取5-10ul加入100ul样本中,染色1分钟即可。
 楼主| 发表于 2018-1-20 19:18:43 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-1-20 17:25
因为你是区分死活的,所以不需要加Triton。
PI一般用10ug/ml,取5-10ul加入100ul样本中,染色1分钟即可。 ...

老师,请问10ug/ml是指终浓度吗?还是PI工作液浓度,PI是直接用灭菌PBS配制就可以吧
发表于 2018-1-20 20:29:18 | 显示全部楼层
HYL20180112 发表于 2018-1-20 19:18
老师,请问10ug/ml是指终浓度吗?还是PI工作液浓度,PI是直接用灭菌PBS配制就可以吧 ...

工作液浓度。不需要灭菌。
 楼主| 发表于 2018-1-21 08:55:03 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-1-20 20:29
工作液浓度。不需要灭菌。

好的,知道了,老师,区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右?我用的慢速5min。
 楼主| 发表于 2018-1-21 10:58:29 | 显示全部楼层
HYL20180112 发表于 2018-1-21 08:55
好的,知道了,老师,区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右?我用的慢速5min。 ...

1700 on FSC-H
发表于 2018-1-22 14:10:34 | 显示全部楼层
HYL20180112 发表于 2018-1-21 08:55
好的,知道了,老师,区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右?我用的慢速5min。 ...

首先,不知道你的机器是什么型号,其次,每台机器的设置可能都不同,所以单纯问我设多少阈值,我回答不出来。
 楼主| 发表于 2018-1-25 18:07:31 | 显示全部楼层
老师,我用0.22微米的荧光微球测试了,大概在400FSC-H左右。但是PI染色的效果不是很好,我用的PI工作液浓度为100ug/ml,取样1ml,加入10ul工作液染色5min,610/20 BP装载在FL1通道,用的BD Accuri C6,分析数据软件Cflow
 楼主| 发表于 2018-1-25 18:08:58 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-1-22 14:10
首先,不知道你的机器是什么型号,其次,每台机器的设置可能都不同,所以单纯问我设多少阈值,我回答不出 ...

我的PI是直接用PBS配制的,是不是应该加入RNA酶去除PI染色到RNA的影响?
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