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[凋亡检测] 细胞凋亡结果

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发表于 2018-2-7 18:18:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
各位老师,我用的是HepG2贴壁细胞
操作过程如下:
1.     细胞未进行任何处理(不加药)。去除培养基,用PBS洗一遍。再用刮刀把细胞刮下来,加入PBS吹打后,200g离心3min,洗两次。
2.     用双蒸水稀释5 × Binding Buffer为1 × 工作液,取500 μl 1 × Binding Buffer重悬细胞。
3.     每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI。
4.     混匀后,室温避光孵育5分钟。
5.     上机检测
计数3万个细胞。

但是看了结果,怎么觉得都死了?
流式新手,一脸懵逼,请老师指点一下。谢谢

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应该是0.25%或者0.05%, 我都用过,0.05%的更好控制一些,我比较倾向0.05%, 我养的多数是endothelial cells,所以铁壁不是特别牢。当然也要根据不同细胞调整,起码要能消化下来。
发表于 2018-2-7 18:18:45 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-2-14 08:21
哦,确认一下Trypsin胰蛋白酶的浓度,前面写了两个,一个是0.02%,一个是0.05%,请问一下你用的是哪个 ...

应该是0.25%或者0.05%, 我都用过,0.05%的更好控制一些,我比较倾向0.05%, 我养的多数是endothelial cells,所以铁壁不是特别牢。当然也要根据不同细胞调整,起码要能消化下来。
发表于 2018-2-8 08:17:23 | 显示全部楼层
是的,看FSC和SSC,以及染色结果,应该是都碎了。
发表于 2018-2-8 12:31:53 | 显示全部楼层
不要刮,要消化。
发表于 2018-2-8 23:58:07 | 显示全部楼层
刮死了,可以用0.02% Trypsin 处理,显微镜下密切关注,然后及时用血清终止消化,将消化过的细胞离心收集,[用原培养基重选,37度 Rotating 孵育45分钟恢复表面抗原],如果检测Annexin V, [  ] 里面的可省略。
发表于 2018-2-9 11:11:16 | 显示全部楼层
robert1988 发表于 2018-2-8 23:58
刮死了,可以用0.02% Trypsin 处理,显微镜下密切关注,然后及时用血清终止消化,将消化过的细胞离心收集, ...

robert在贴壁细胞上测试过效果如何?好像养贴壁细胞很多同学都提到此类问题。
发表于 2018-2-9 21:30:49 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-2-9 11:11
robert在贴壁细胞上测试过效果如何?好像养贴壁细胞很多同学都提到此类问题。 ...

效果很好,复原时间根据消化难易程度决定,一般0.05% Tripsin 处理5分钟的, 对应45分钟复原。

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发表于 2018-2-10 08:55:37 | 显示全部楼层
robert1988 发表于 2018-2-9 21:30
效果很好,复原时间根据消化难易程度决定,一般0.05% Tripsin 处理5分钟的, 对应45分钟复原。 ...

@robert1988 兄 有空的时候放几张分析结果上来分享一下,很好的技巧,可以帮助很多站友解决此类难题。
发表于 2018-2-13 02:07:14 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-2-10 08:55
@robert1988 兄 有空的时候放几张分析结果上来分享一下,很好的技巧,可以帮助很多站友解决此类难题。 ...

时间有点久了,阴性的图不好找了。这么说吧,我有种表面抗原,如果Tripsin处理3到5分钟,然后PBS+FBS或者FCR blocker 孵育,然后染色,基本上抗原检测不到,如果按照所述方法孵育复原,90%以上的细胞为阳性。时间太久,图难找,见谅。
发表于 2018-2-13 08:14:42 | 显示全部楼层
robert1988 发表于 2018-2-13 02:07
时间有点久了,阴性的图不好找了。这么说吧,我有种表面抗原,如果Tripsin处理3到5分钟,然后PBS+FBS或者 ...

@robert1988 兄,不是说检测抗原,是指贴壁细胞的Annexin V、PI凋亡散点图,因为很多研究生做出来贴壁细胞的AV/PI双阳性信号特别多,用你说的方法,是否可以避免这些情况?
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