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[标本处理] 在10多次的洗涤后,怎样保留更多的淋巴细胞

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发表于 2018-2-10 12:51:50 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 luyexianzong 于 2018-2-10 12:58 编辑

从外周血分离淋巴细胞后经以下步骤处理上机检测。
1. Fc 封闭后,洗涤3次,
2.Live/Dead 染色后,洗涤2次,
3.表面抗原染色后,洗涤3次,
4.固定/透膜,洗涤2次,
5.胞内抗原染色,洗涤2次。

以在EP管、96孔板和48孔板均操作过。
在Fc封闭前,细胞计数均在2x10^6以上,但是待这些处理完之后,细胞数量已经少的可怜。
EP管内处理的略好,但是细胞板中处理的细胞数目非常少?

EP管处理慢,细胞板处理快。
请问大家有没有好的办法?
调整合并步骤,或者有小的技巧,欢迎赐教。
感激!




发表于 2018-2-10 18:20:25 | 显示全部楼层
首先我觉得你既然是胞内染色要固定破膜的,肯定都是死细胞,那死活染料那一步就可以直接去掉了,另外封闭Fc,表面抗原的洗涤都可以缩减到1次,最后胞内染色以后可以洗2-3次。。。我一般偷懒的时候封闭完Fc端不洗直接染表面抗原的。。。洗太多次如果操作不好很多稀有亚群估计都检测不到了
发表于 2018-2-11 08:38:55 | 显示全部楼层
96孔板可以用U型或者V型的。两百万个细胞其实并不多,可以多加一点
 楼主| 发表于 2018-2-11 08:44:58 | 显示全部楼层
ghqiu09 发表于 2018-2-11 08:38
96孔板可以用U型或者V型的。两百万个细胞其实并不多,可以多加一点

多谢!原始细胞数,没法提高太多。由于外周血的采血量受限制了,最多0.5ml.
 楼主| 发表于 2018-2-11 08:46:20 | 显示全部楼层
chevalierx 发表于 2018-2-10 18:20
首先我觉得你既然是胞内染色要固定破膜的,肯定都是死细胞,那死活染料那一步就可以直接去掉了,另外封闭Fc ...

谢谢!正在考虑根据最终的检测目的,减少一些步骤。非常感谢!
发表于 2018-2-12 08:39:11 | 显示全部楼层
都可以只洗一次的,但是建议在流式管,大体积洗涤。

点评

另外,再向倪老师了解一个问题。有没有破解版或者demo版的DIVA,自己练手。多谢!  发表于 2018-2-12 12:50
多谢!有倪老师的回复就更放心了!改成流式管,1 ml 洗涤液。 心疼洗涤液啊!哈哈!  发表于 2018-2-12 12:48
发表于 2018-2-12 14:06:08 | 显示全部楼层
luyexianzong 发表于 2018-2-11 08:46
谢谢!正在考虑根据最终的检测目的,减少一些步骤。非常感谢!

洗涤只需要PBS即可,1ml不够,至少需要2ml甚至更多,成本怎么会高呢?BSA可加可不加。
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