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[结构和原理] 流式双荧光染色

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发表于 2018-3-12 20:46:46 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
本帖最后由 zy北极星 于 2018-3-12 20:49 编辑

老师您好,我最近在做流式双荧光染色,我们发现所研究的病毒能够侵染鱼类白细胞,且发现白细胞上存在该病毒的受体蛋白,为了共定位白细胞上的病毒和受体蛋白,将白细胞提出来后孵育病毒的兔多抗和受体蛋白的鼠多抗,荧光二抗用的是Dylight 488 羊抗兔和Dylight 488 羊抗鼠,两种一抗和二抗混合在一起孵育细胞,也做过先孵育受体的一抗和二抗然后孵育病毒的一抗和二抗,但是流式结果出来的图如图所示,从左到右分别对应的是:病毒单染、受体蛋白单染、病毒和受体蛋白双染。理论上病毒感染细胞是一个动态的过程,不会在某个时间点所有含有受体的细胞都被病毒感染,也就是说第三张图片中第四象限共染的那部分细胞不正常,因为至少应该存在受体蛋白单染的一部分细胞,我对流式了解的不是很多,希望老师能帮我提出问题,解答疑惑,万分感谢! lcdv.png rack.png racklcdv.png

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流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2018-3-13 09:18:11 | 显示全部楼层
你两种二抗都是Dylight488,为什么选了两个通道检测?
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 楼主| 发表于 2018-3-13 14:27:46 | 显示全部楼层
本帖最后由 zy北极星 于 2018-3-13 14:28 编辑

抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个
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 楼主| 发表于 2018-3-13 14:28:07 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-3-13 09:18
你两种二抗都是Dylight488,为什么选了两个通道检测?


抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个
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 楼主| 发表于 2018-3-14 22:47:34 | 显示全部楼层
zy北极星 发表于 2018-3-13 14:28
抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个 ...

病毒的兔抗使用的是Dylight649羊抗兔二抗,受体蛋白的鼠抗使用的是Dylight488羊抗鼠二抗,两个二抗的激发波长不同,所以选择的是两个通道,只是我不知道为什么,两个抗体做单染的时候都是没有问题的,细胞分群很明显,但是两种抗体一起做双染就出现了如同对角线的共染细胞群,之前有看到过说这样对角线形状的细胞是死细胞,也有说两种抗体需要分开孵育,但是我试过抗体分开孵育,和一起孵育的情况一样,实在找不出原因,各路大神和老师给提提意见,多谢了~~~
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发表于 2018-3-15 20:29:52 | 显示全部楼层
zy北极星 发表于 2018-3-14 22:47
病毒的兔抗使用的是Dylight649羊抗兔二抗,受体蛋白的鼠抗使用的是Dylight488羊抗鼠二抗,两个二抗的激发 ...

那看来可能还是非特异性结合的问题了。
我建议你试试下面的步骤:
1、病毒一抗+受体一抗
2、488羊抗鼠
3、649羊抗兔
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 楼主| 发表于 2018-3-17 20:18:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-3-15 20:29
那看来可能还是非特异性结合的问题了。
我建议你试试下面的步骤:
1、病毒一抗+受体一抗

谢谢老师的解答,我再试试看
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