肥胖并发糖尿病，是谁的罪？

niwanmao

免疫细胞在皮下和内脏脂肪组织（AT）浸润诱发的轻度炎症，可导致肥胖相关并发症如2型糖尿病。内脏脂肪组织（vAT）中促炎免疫细胞的积累导致胰岛素抵抗，这是发展为2型糖尿病的主要危险因素。在肥胖皮下脂肪中，可见到先天性和适应性免疫系统的免疫细胞，如巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、CD4 +和CD8 + T细胞以及B细胞， 这些免疫细胞与内皮细胞、基质细胞、脂肪细胞祖细胞、成纤维细胞和pericytes一起构成SVF，是脂肪组织中促炎物质的主要来源。

AT的炎症状态通常通过包括Western印迹、qPCR和免疫组织化学在内的技术进行研究。然而，这些技术使用整个AT组织，这使得很难确定AT中存在的免疫细胞的数量和亚群。

免疫细胞具有各种细胞标记，可用于区分不同亚群，例如巨噬细胞在功能和细胞表面标志物表达上存在异质性，它们通常被分为两个巨噬细胞群：M1和M2。 M2巨噬细胞通常在偏瘦、新陈代谢正常人的AT中占优势。然而，在肥胖期间，从M2巨噬细胞到M1巨噬细胞发生表型转换。这些经典活化的M1巨噬细胞表达CD11c并在死亡的脂肪细胞周围堆积形成冠状结构。已有文献认为AT中的CD11c +巨噬细胞损害胰岛素作用并且与肥胖人群中的胰岛素抵抗相关。

免疫组化是区分AT中的M1和M2巨噬细胞的一种选择，该技术可提供关于巨噬细胞在组织中的位置的信息，但是，组化每次标记的数量有限，而且量化也很困难。

因此，可以用流式细胞术来研究vAT（内脏脂肪组织）和sAT（皮下脂肪组织）中不同的免疫细胞亚群，找出肥胖并发症背后的凶手。

试剂

1、胶原酶溶液
（1）将1g胶原酶I 溶解在10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，不含钙和镁）中以制备100mg/mL储存液。 分装成200μL/管，储存在-20°C。
（2）将1g胶原酶XI溶解在10ml PBS中制成100mg/ml的储存液。  分装成200μL/管，储存在-20°C。
（3）将10mg的DNA酶I溶解在10mL的PBS中以制备10mg/mL的储存液。  分装成180μL/管，储存在-20°C。
（4）向10mL DMEM Ham's F12中加入100μL胶原酶I（100mg / mL），100μL胶原酶XI（100mg / mL）和90μLDNA酶I（10mg / mL）。该溶液需要在每次分离前新鲜配制。
2、红细胞裂解液
（1）取0.84g氯化铵，溶解于100ml超纯水中。
（2）调节pH值至7.4，保存于4度玻璃容器中。
（3）使用前将红细胞裂解液置于冰上。
3、流式缓冲液
（1）将0.5g牛血清白蛋白（BSA）溶于100mL PBS中以获得0.5％BSA PBS。
（2）将65mg的NaN3溶解在100mL 0.5％BSA PBS中以获得10mM NaN3 0.5％BSA PBS。 保存于4度玻璃容器中。
（3）使用前将流式缓冲液置于冰上。
警告：NaN3有剧毒。 在处理NaN3时，应在通风橱中工作并佩戴防护眼镜和手套以保护身体。
4、人IgG阻断剂
（1）将10mg人IgG溶解在10mL PBS中以获得1mg/mL阻断剂。分装为100ul，储存在-20°C。
（2）使用前将人IgG阻断剂块放在冰上。

从脂肪组织中分离基质血管部分
（1）用手术刀将1g AT（脂肪组织）活检物切成小块（±2平方毫米）并转移到50毫升离心管（例如Falcon管）中。每个AT样品添加10毫升胶原酶溶液。
（2）在轻轻振荡（60次/分钟）下，在37℃水浴中孵育60分钟。
（3）用200μM过滤器过滤所得悬浮液，并将样品收集在新的50mL离心管中。在过滤器中再加入7mL PBS以冲洗过滤器并获得所有细胞。
（4）在4℃下以280×g离心样品5分钟。
（5）通过移液器去除漂浮的脂肪细胞部分，剩余的细胞沉淀就是SVF（stromal vascular fraction，基质血管部分）。
注意：去除脂肪细胞部分获得SVF时，需避免将整个枪头顶端浸没在样品中，因为这只会去除PBS而不是漂浮的脂肪细胞。
（6）用5 mL PBS重悬SVF以去除胶原酶，用70μM过滤器过滤悬浮液，用5 mL PBS冲洗过滤器，并在4°C下将样品以280 x g离心5分钟。
（7）去除上清液，用3ml 红细胞裂解缓冲液重悬。
（8）在冰上孵育5分钟。孵育后加入7mL PBS。
（9）在4℃下以280×g离心样品5分钟。

SVF细胞染色、上机

（1）将细胞沉淀用90μL 4°C FACS缓冲液重悬，并加入10μL 1mg/mL人IgG阻断剂。将细胞悬液分到v形96孔板中的2个孔，再将平板置于冰上，让人IgG阻断剂孵育15分钟。
（2）每个样品加入100μLFACS缓冲液进行洗涤，并在4°C用280 x g离心5分钟。将平板颠倒翻转，以平滑的运动方式弃去上清液，而无需轻敲平板。
注意：可以使用吸水纸尽量吸干倒置平板里面剩余的液体。
（3）加入抗体组合，如第1步所述，两个孔依次对应巨噬/DC和T/B亚群。
管1，检测巨噬细胞和DC亚群，抗体克隆号、荧光素方案、用量如下：


管2，检测T、B、NK亚群，抗体克隆号、荧光素方案、用量如下：


注意：可在组合中加入死活鉴别染料。
（4）振荡重悬，置冰上避光孵育30分钟。
（5）向每个孔中加入150μL流式缓冲液并重新悬浮细胞沉淀以进行第二次洗涤步骤。在280 x g和4°C下离心平板5分钟，倒置平板倒掉上清液。
（6）向每个孔中加入150μL 1％多聚甲醛溶液以固定细胞。将样本从各孔转移到相应的流式管。如果直接测量可以直接加150μL 流式缓冲液代替1％多聚甲醛。

流式分析和设门

下图就是设门步骤。
A图从左到右依次是排除粘连体→排除碎片→选择CD45＋白细胞；
B图在A图设门基础上，通过选择CD19、CD3、CD66b、CD56阴性而CD11b＋的区域，排除B、T、粒、NK等细胞，然后通过CD11c/CD11b散点图，CD11b+ CD11c+ 巨噬细胞 (暗绿色), CD11b+ CD11c- 巨噬细胞 (紫色)和CD11b low/- CD11c+树突状细胞(蓝色)。
C图则是分析CD11b+ CD11c+ 巨噬细胞和CD11b low/- CD11c+树突状细胞上面的CD303、CD141的表达。
D图则是分析总T、CD4＋T、CD8＋T、NK、B细胞。



下面来看胖子和瘦子之间CD11b+ CD11c+ 巨噬细胞比例上的差异：



操作视频请访问参考文献链接：
https://www.jove.com/video/57319 ... e-tissue-using-flow