可以固定后，加入一抗2天吗？

zhang4083

近日需要做一个非常关键的时候，但是最后一天需要检测流式，由于时间的安排，周六收细胞，

因为单位周六不能给做流式，所以只能预约到下周一，所以我的问题来了，

第一个问题：周六细胞固定（4%多聚甲醛）后，可以把一抗加入细胞中孵育大约1天零10个小时，然后下周一早晨进行二抗操作，这样可以吗？
第二个问题：我因为需要加入live/dead试剂去区分活细胞和死细胞，何时加入比较好？我看文献，都是在固定前加（但是他们都是当天完成的所有步骤），我这种情况，何时加入live/Dead染色剂？

niwanmao

1、是否可以固定，需要事先进行验证对比，避免抗体受固定影响，之前站内发过帖子列出了一些抗体，你可以先对对看，没有的话一定要验证过。
2、死活染料肯定是要固定前加入，但固定后能存多久，不清楚。

其实我的建议是用咱们的FlowGuard细胞保存液，保存2～3周再染色，一点问题都没有，唯一的不足是FSC会变小，但其它指标很稳定，所以纯良心推荐。至于死活，其实不一定非要使用Live/Dead，在一些文献上，通过排除粘连体、FSC/SSC、CD45/FSC等方式也可以很好地把大部分死细胞排除掉。

zhang4083

niwanmao 发表于 2018-4-23 19:56
1、是否可以固定，需要事先进行验证对比，避免抗体受固定影响，之前站内发过帖子列出了一些抗体，你可以先 ...

谢谢老师的解答，我现在的实验已经准备好了，也没有保存的细胞保存液，

所以只能是固定了，还好不是细胞膜的抗原，而是细胞核的抗原，

只能硬着头皮先固定再说。