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[流式相关软件] 流式荧光补偿和FMO对照

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发表于 2018-5-7 13:10:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 marvelwong 于 2018-5-7 13:12 编辑

1)我想请问一下,我的4标(CD45-PerCp, CD117-APC, Ly6A/E-FITC, CD309-PE)加细胞死活染料(V450)。请问这个需要怎么补偿?

2)FITC和PE补偿的时候,上FITC单染管调PE补偿,那上PE单染管还需不需要调FITC补偿?

3)还有就是APC和PerCP虽然说是不同激发光,理论说不需要补偿,可是试剂发现还是会有好多溢漏,所以这个还是需要补偿吗?

4)4色的FMO对照就是标4个管子,每个管子缺一个抗体,也不加ISO,是这样子吗?
谢谢。



发表于 2018-5-7 19:35:59 | 显示全部楼层
1、V450死活染料与其它通道没有补偿,所以不用做补偿管,其它几管,还得看你目的要检测什么指标,如果你是要用CD45设门,那么只需设置:
CD45、CD117、CD309
CD45、CD117、Ly6C/E
CD45、CD309、Ly6C/E
2、见上
3、理论不需要,但实际上还需要看仪器。
4、不用Isotype,但建议事先进行Fc Blocking。
 楼主| 发表于 2018-5-7 19:48:42 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-5-7 19:35
1、V450死活染料与其它通道没有补偿,所以不用做补偿管,其它几管,还得看你目的要检测什么指标,如果你是 ...

谢谢倪老师。
1)问题1的回答没有看懂。
先用CD45-/dim CD117+的设门选定细胞群。
2)针对问题3),我使用的仪器是BD FACSCanto。 实际在使用微球做补偿的时候,APC,PerCP和PE三者之间存在溢漏。
发表于 2018-5-8 13:52:28 | 显示全部楼层
marvelwong 发表于 2018-5-7 19:48
谢谢倪老师。
1)问题1的回答没有看懂。
先用CD45-/dim CD117+的设门选定细胞群。

不是让你选择那类细胞,而是通过那三管FMO对照,依次调节未加抗体通道的补偿渗漏。
 楼主| 发表于 2018-5-9 18:08:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-5-8 13:52
不是让你选择那类细胞,而是通过那三管FMO对照,依次调节未加抗体通道的补偿渗漏。 ...

好的,谢谢倪老师。
还有一个问题,我的细胞分群不明显而且全血中的含量很低,除了CD45,其他抗体的阳性率都很低,我可不可以用微球来替代细胞做FMO对照?
或者是不是只能替换抗体,使用同样荧光素和isotype的,但表达含量较高的分子抗体?谢谢。
发表于 2018-5-10 07:56:12 | 显示全部楼层
marvelwong 发表于 2018-5-9 18:08
好的,谢谢倪老师。
还有一个问题,我的细胞分群不明显而且全血中的含量很低,除了CD45,其他抗体的阳性 ...

同样荧光素、同样亚型的替换抗体,是用于调节补偿,不是做FMO的。
按照你所说的,你的实验目的是选择CD45-/dim CD117+的原始细胞,那么说明最后只需要分析Ly6C/E和CD309的表达,所以FMO就做两管:
CD45、CD117、CD309
CD45、CD117、Ly6C/E
用这两管设置出依次设置Ly6C/E、CD309的Marker位置,最后上实验管,就可以正确测出两个标记的表达率。
但是事先必须进行Fc Blocking,可用Fc Blocking Solution,也可以用BSA
 楼主| 发表于 2018-5-10 09:44:11 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-5-10 07:56
同样荧光素、同样亚型的替换抗体,是用于调节补偿,不是做FMO的。
按照你所说的,你的实验目的是选择CD45 ...

好的,十分感谢倪老师的解答。
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