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[其它] 流式检测金黄色葡萄球菌的ROS

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发表于 2018-5-14 14:44:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
实验步骤如下:

1、将1mM和10mM 的H2O2与细菌共培养3h后, 4℃ 12000 g离心15 min沉降细菌,PBS重悬,少量,用枪慢慢吹打清洗细菌。

2、  4℃ 12000 g离心弃上清,PBS清洗1-2次。

3、 加入100ul终浓度为10uM的DCFH-DA,37℃ 5% CO2培养箱中静置0.5 h,每隔5min混匀一下,使探针和细菌充分作用。(DCFH-DA为碧云天的试剂盒)

4、 4℃ 12000 g离心弃上清,用预热的PBS液洗涤细菌3次,去除未进入细菌内的DCFH-DA。

5、500ul PBS重悬,上流式细胞仪检测ROS。激发光488nm,发射光 525nm,选择FL1通道进行检测,检测细菌数目为50000个。

困惑:

1、Blank组和1mMH2O2和10mM H2O2的荧光强度也没有差别,一般来说用H2O2刺激后均会产生ROS,但是在这次实验中并未发现荧光变强。

2、由于细菌和细胞的结构不一致,是否需要对细菌进行破壁处理,才能使探针进入细菌?

3、实验步骤是否有不恰当的地方,谢谢。

4、第一个小峰代表什么?




流式检测金黄色葡萄球菌ROS

流式检测金黄色葡萄球菌ROS
发表于 2018-5-14 22:31:47 | 显示全部楼层
细菌没做过,从相关的文献实验方法来看,你可以考虑延长孵育时间至1小时看看:
https://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/753419/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5566361/#__sec6title

另外,请将未加染料的散点图和处理过的散点图同时放出来看看,设门建议还是先通过FSC/SSC来进行。前面的小峰可能就是因为一些异常信号的掺入。
 楼主| 发表于 2018-5-15 17:59:12 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-5-14 22:31
细菌没做过,从相关的文献实验方法来看,你可以考虑延长孵育时间至1小时看看:
https://www.hindawi.com/jo ...

谢谢老师的回复,由于是第一次做细菌的流式,在设置实验的时候没有考虑周全,并没有设置未加染料这个组别,我打算过两天设置PBS组,未加染料的细菌组,细菌加染料,细菌加染料加过氧化氢刺激再进行上机检测看看结果怎么样。而且由于我们这边的检测老师也没做过细菌的,在圈门的时候也不知道该圈在哪个位置。
 楼主| 发表于 2018-5-17 20:53:39 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-5-14 22:31
细菌没做过,从相关的文献实验方法来看,你可以考虑延长孵育时间至1小时看看:
https://www.hindawi.com/jo ...

老师,您好,我今天重新做了一批流式检测ROS的实验,但是结果仍然没有太大的区别。这次我用过氧化氢对金黄色葡萄球菌刺激18h后,离心,PBS清洗,加10um的DCF探针孵育30min,每隔5min混匀,离心,PBS清洗,500ulPBS重悬,上机,488/525nm进行检测。还是不太清楚问题出现在哪里,希望老师能够对我进行指导。谢谢。

金黄色葡萄球菌未加探针

金黄色葡萄球菌未加探针

金黄色葡萄球菌加探针

金黄色葡萄球菌加探针

金黄色葡萄球菌加1mM过氧化氢刺激

金黄色葡萄球菌加1mM过氧化氢刺激
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