查看: 1504|回复: 18
收起左侧

[结构和原理] percp-cy5.5和apc染料为什么能够共染?从流式仪结构上解释不通

  [复制链接]
发表于 2018-5-16 21:52:08 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本人实验室中的流式仪的型号是bd facsverse。在bd官网光谱查看器中查看默认滤光片的时候,发现有个问题解释不通。

如图,用635nm激光器激发apc染料,总发射荧光的22.4%(见括号1)可以被BD公司推荐的滤光片660/10所接收,但同时有总发射荧光的30%(见括号2)被percp-cy5.5的推荐滤光片700/54所接受,即apc漏光到percp-cy5.5通道的apc的荧光强度是30%。
此percp-cy5.5通道接受APC的荧光强度大于APC的本身通道接收的效率,虽然percp-cy5.5和apc不是一个激发光激发(一个488nm,一个635nm),但是在635nm激光激发的条件下,percp-cy5.5接收的apc荧光强度反而大,为什么apc和percp-cy5.5还能共染而不串光呢

percp-cy5.5和apc默认滤光片

percp-cy5.5和apc默认滤光片
发表于 2018-5-16 22:14:57 | 显示全部楼层
注意看第二列那个%Max, 在635nm激发下,PerCP-Cy5.5只有10.2%的发光强度,而APC则是73.7%。
而如果你换到488nm,就能看到PerCP激发强度为98.4%,APC只有1.1%。
你可以大概认为真正的信号比应该是APC:0.73*0.224, PerCP: 0.102*0.3,也就是635nm下,大概APC:PerCP=16:3,而488nm下,APC几乎不激发,这种情况完全在补偿可控范围。
 楼主| 发表于 2018-5-16 22:48:21 | 显示全部楼层
robert1988 发表于 2018-5-16 22:14
注意看第二列那个%Max, 在635nm激发下,PerCP-Cy5.5只有10.2%的发光强度,而APC则是73.7%。
而如果你换到48 ...

首先感谢您的解答,您的意思我懂,我也考虑到了,我觉得您说的这个理论在这个表格横向比较是对的,横向指的是各荧光漏到这个滤光片 占各个荧光的比例,就算是漏到这个滤光片的百分比 比较大,只要是该波长的激光激发下,该荧光的激发效率低,那么也没有关系。

但是现在是纵向比较,在635nm的激发光下,确实有30%强度的apc进入了percp(percp-cy5.5)通道,即进入到该通道光电倍增管的光都应该认为是percp的,关键是现在是apc的光进入到了percp通道,并且还比本身通道的光要强。
发表于 2018-5-16 23:20:01 | 显示全部楼层
PerCP的接收器在蓝光488,红光激发的那部分不接收
 楼主| 发表于 2018-5-16 23:30:59 | 显示全部楼层
robert1988 发表于 2018-5-16 23:20
PerCP的接收器在蓝光488,红光激发的那部分不接收

能具体讲一讲结构吗,或者有没有相关文献,我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发,同一荧光走的滤光片不都是一个吗?比如我们实验室的verse就只按了一个七角型检测器,无论是488和635nm的激光激发出来荧光以后,都要走该检测器啊?
发表于 2018-5-17 10:35:08 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗,或者有没有相关文献,我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发,同一荧光走的滤光片 ...

这跟光路结构设计有关,他们这些光路设计都是有专利的,可以将串色减到最小,所以这就是为什么同样的东西,不同公司生产出来的机器,其补偿值完全。
你们的配置是单激光?不应该啊,现在很少用单激光的吧。不同激发光走的是不同的通路的。
发表于 2018-5-21 15:55:31 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗,或者有没有相关文献,我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发,同一荧光走的滤光片 ...

这个流式采集信号的策略有关,以BDaria分选机器为例,共有三根激光照射流动室,从上往下为红633,蓝488,紫405,这样单个细胞在液流里从上往下移动,会在不同的时间依次经过三根激光,三根激光激发产生的荧光信号也会在不同时间点被PMT检测到。BD以细胞经过蓝光的时间设为0,这样假设经过红光为-50ms(实际根据机器调整),经过紫光为50ms,软件将这三个时间点检测到的信号认为是一个细胞,这就是laser delay的概念。也就是说,percp-cy5.5的荧光信号是在经过488蓝光时激发并检测的,而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp-cy5.5的信号”,而488激发apc的效率很低,所产生的荧光信号也很弱。而我们分析数据看到apc的信号是在细胞经过633红光时激发并被检测到的,很强。相互比较一下,“apc漏到percp-cy5.5的信号(488激发)”比起真正的apc荧光信号(633激发)来说极弱,即补偿值很小。这也是被不同激光激发的荧光染料相互之间补偿值比较小的原因。

评分

参与人数 1流星 +5 收起 理由
niwanmao + 5 很给力!

查看全部评分

发表于 2018-5-21 15:56:52 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗,或者有没有相关文献,我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发,同一荧光走的滤光片 ...

laser delay
Screenshot_20180521-145757.jpg
 楼主| 发表于 2018-5-25 20:17:47 | 显示全部楼层

您这句话我不太懂,“而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp-cy5.5的信号”,” 现在图上是 635红光 激发器激发的APC产生的荧光。
那635红光激发 APC产生的荧光不会漏到percp-cy5.5通道里面吗?
发表于 2018-5-26 20:02:51 | 显示全部楼层
immunology 发表于 2018-5-25 20:17
您这句话我不太懂,“而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp ...

通道流式一般一根激光器对应一套PMT检测器(直列或8角或三角),比如BD Aria II红蓝紫三根激光有三套PMT。根据我现有知识的理解,一套PMT只记录其对应激光激发的荧光信号的机制应该是这样的:细胞依次经过红蓝紫三根激光,被蓝激光激发的荧光通过透镜和光纤同时被三套PMT检测到,但是软件只记录蓝激光对应通道(包括SSC,FITC,PE,Percp-cy5.5,PE-cy7等)的信号。根据laser delay,在-50ms时被红激光激发的信号,只记录其对应的通道(APC,A700,APC-cy7等);而在50ms时被紫激光激发的信号,只记录相应通道(BV421,BV510,BV650).最后软件把分别记录三根激光激发的信号整合到一起,才构成一个细胞所有通道的信号。这样就能够保证不同激光激发的荧光信号互相不干扰,这也是以前flower们常说的“不同激光器激发的荧光不溢漏”。但是我们在分析数据的时候确实也发现如Percp-cy5.5和APC之间确实有补偿,这是因为在记录Percp-cy5.5信号时Apc同时也被蓝激光激发了(虽然效率很低),也就有了我们分析数据时看到的“APC会漏到percp-cy5.5”。但是这不是你理解的APC被红激光激发的信号漏到了Percp-cy5.5,因为被红激光照射时软件根本不记录percp-cy5.5通道的荧光信号。
c1278739876372332570f81087c3a1f9.jpg
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

流式中文网    

联系我们: mail#flowcyto.cn (#改为@)

GMT+8, 2018-10-19 00:19

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.