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[流式分选] 流式分选小鼠脾NK细胞

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发表于 2018-7-2 13:15:29 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
大家好,最近我的实验需要从小鼠脾脏中提取NK细胞,CFSE标记后回输同种小鼠体内。

做了两次预实验,遇到几个问题希望能有大神来帮忙指点一二

我的步骤:
1、 BD 70微米细胞筛机械研磨制作脾单细胞悬液,预冷DPBS 500g/5min 水平离心机常温离心清洗(细胞房无低温离心机) ,室温15min 裂红,DPBS清洗2次
2、stain buffer 中重悬(5%FBS+1X DPBS),计数,调整至 1X10^7/ml,抗体浓度按照推荐用量计算(NK1.1-PE, CD3e-FITC),加入。冰上避光30min, DPBS洗两次,重悬,调整细胞量至5x10^7/ml上机,选NK1.1+CD3-细胞群(占总淋巴细胞3%左右)
3、 接收管用5%FBS+DPBS包被,在4℃摇床上过夜,上机前倒出大部分液体,留管底液(约0.5ml)

问题:
1、纯度问题:整个分选上机过程持续2h,分选刚开始时回测纯度约为90%,分选结束时回测纯度只有80%左右了,在前向侧向角中看到细胞碎片很多,不知道是否是我接收管里选择的接收液问题?还是分选过程中在室温下,时间过长细胞死亡?还是机子机械性损伤?求解决办法
2、细胞得率:一个脾脏我大约可得单细胞悬液5X10^7个细胞,5个脾脏混在一起分选,第一次做流式分选仪显示收集5x10^5个目标细胞,第二次只有2x10^5个细胞,看到回输实验至少要10^6级细胞,如果要提取这么多细胞是不是磁珠分选更为合适一点?
3、 收集好的细胞要回输回小鼠体内,是不是FBS,BSA等都算是一外源性蛋白,PBS可以直接清洗掉这些蛋白吗?接收液,stain buffer中为保持细胞活性我都加入了FBS,不知道会不会有影响。



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发表于 2018-7-3 12:48:17 | 显示全部楼层
分选比例比较低的细胞感觉还是用磁珠的方法比较好,流式分选需要的时间太长了
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 楼主| 发表于 2018-7-20 12:23:58 | 显示全部楼层
ghqiu09 发表于 2018-7-3 12:48
分选比例比较低的细胞感觉还是用磁珠的方法比较好,流式分选需要的时间太长了 ...

感谢,下一步准备磁珠阴选富集后再流式分选。
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发表于 2019-7-30 17:11:08 | 显示全部楼层
楼主请问下,你标记NK细胞的参考文献可否发个题目或者DOI,新手做脾脏NK,想看下NK的自然杀伤能力是否提高,有方法吗?,感谢万分!
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发表于 2019-7-30 21:05:06 | 显示全部楼层
liushixibao 发表于 2019-7-30 17:11
楼主请问下,你标记NK细胞的参考文献可否发个题目或者DOI,新手做脾脏NK,想看下NK的自然杀伤能力是否提高 ...

标记NK很简单啊,用CD45、CD56、CD16、CD3即可。
如果要测NK杀伤能力,就得把单个核细胞提出来或用磁珠把NK细胞分选出来,再与肿瘤细胞(如K562)共培养。
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 楼主| 发表于 2019-7-31 14:22:52 | 显示全部楼层
liushixibao 发表于 2019-7-30 17:11
楼主请问下,你标记NK细胞的参考文献可否发个题目或者DOI,新手做脾脏NK,想看下NK的自然杀伤能力是否提高 ...

做小鼠的 ?标记CD3e和CD49b/NK1.1/NKP46 看品系选NK的marker。这个文献很多,杀伤能力可以与YAC-1细胞共培养获得,具体我没做过。
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