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激光一直照着,为什么没有细胞通过时,流式没信号

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发表于 2018-7-11 14:51:38 | 显示全部楼层 |阅读模式

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除了计数细胞外,流式还可以了解细胞的物理、化学或生物特性。流式细胞术检测到细胞的主要物理特性,是利用它们衍射、反射和折射激光相干单色光的能力。

当激光形成窄且聚焦的相干光遇到细胞(所谓的事件)时,其衍射强度与“事件”的大小成比例。流式细胞仪配备有光电二极管,用于收集激光束路径中的细胞衍射产生的光,即前向散射光(FSC)。那么这个时候可能就有FLOWER问了,如果这样的话,没有细胞通过的时候,激光也应该一直照着光电二极管,应该是源源不断的产生信号才对,为什么只有细胞通过时才会有反应呢?

看下面这个图:
屏幕快照 2018-07-11 下午1.11.28.png
图中的红点就是流式细胞仪配备的遮光板,正是此物,才使得没细胞通过时,光电二极管不会收集到错误的光信号(上图a)。只有当细胞通过时,光束会根据细胞的大小不同,成比例地扩大,FSC光电二极管可以收集到与细胞大小相关的光信号(上图b)。

除了FSC检测器以外,流式细胞仪还设置了其它光电二极管或光电倍增管(PMT)收集由细胞表面以及其内部的细胞器、囊泡、颗粒等反射的光,这类光与激光前进的方向呈一定角度,所以称为侧向散射光(SSC)信号,其强度与细胞的颗粒度成比例。因此,在血液样本中,没有细胞核的红细胞将SSC非常小,而颗粒较多的的粒细胞SSC大,而如果只有液体而没有细胞通过时,就更加不会出现SSC信号了。不过不同仪器SSC收集的角度会有所不同,甚至目前有些仪器在紫光通道也设置了SSC。

至于荧光参数则更好解释,没有细胞通过,就不会存在结合的荧光素被激光照射,所以就更加不会检测到荧光信号。

最后,赠送大家一张目前最常见的一系列荧光素及其发射、激发光谱和使用的激光器:
屏幕快照 2018-07-11 下午2.48.09.png


参考文献:Anna Porwit, Marie Christine Béné. Multiparameter Flow Cytometry in the Diagnosis of Hematologic Malignancies. Cambridge University Press, Jan 25, 2018
 楼主| 发表于 2018-7-16 13:46:39 | 显示全部楼层

英文名叫obscuration bar
发表于 2018-7-16 20:37:00 | 显示全部楼层
没有细胞时,穿过液流的光束为啥是平行的
 楼主| 发表于 2018-7-17 10:21:39 | 显示全部楼层
私学者 发表于 2018-7-16 20:37
没有细胞时,穿过液流的光束为啥是平行的

只是一个示意图,意思就是因为没有细胞通过,所以光束没有发生散射,非常均匀的一个小光斑,刚好被遮光板挡住。
发表于 2019-1-19 22:14:08 | 显示全部楼层
作者你好!我想请教一些问题:前向收集信号的原理还比较好理解,侧向和荧光信号的收集就很难理解了。一般都是呈一定角度的,这个角度是如何控制的呢?首先当有细胞通过是,前向就一定有信号吗?其次,激光打在液流上,形成衍射环,为啥是环状呢?然后,当用荧光染料上样时,为什么会形成一个长亮的光斑,而用微球上样,却看不到光斑呢?这些都太费解了,都查了一段时间文献了,也没有找到相关的文献,流式的光路系统到底是怎样形成的,希望你能替我解答,感激不尽!
发表于 2019-1-29 23:37:34 | 显示全部楼层
我来回答,答错了别怪。
因为没有细胞的时候没有前向散射,虽然说得是FSC,但是实际上是有角度的,大概5~10度角检测前向。直接正对激光的话,亮度太大,信好太强,估计检测器寿命成问题哦。
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